秦俊哲， 杜軍國， 程 偉

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

蛹蟲草(CordycepsmilitarisLink.)又稱為北蟲草、北冬蟲夏草，隸屬于真菌界的子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)，為蟲草屬(Cordyceps)的模式種[1]，是世界性的廣布種.含有豐富的蟲草菌素、多糖類(半乳糖、甘露醇聚糖)、蟲草酸、核苷類(腺苷、尿苷、鳥苷)及多種氨基酸活性物質(zhì)[2,3]，具有滋肺增精補腎、止血化痰、抑制腫瘤、止咳鎮(zhèn)靜、驅(qū)風(fēng)、散熱、駐容美顏、延緩衰老、提高機體免疫力之功效，它與冬蟲夏草同屬不同種，同樣享有珍惜名貴藥材之譽.我國自20世紀80年代在吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究所人工培養(yǎng)蛹蟲草試驗成功以來[4]，雖然方法不斷改進，但由于影響蛹蟲草人工栽培的因素很多，其人工栽培技術(shù)至今在我國未得到有效的推廣應(yīng)用.究其原因，除了其分化發(fā)育機理及遺傳學(xué)[5-9]基礎(chǔ)尚不清楚外，自身種類多、分布比較廣泛、菌種容易退化、栽培環(huán)境的不易掌控等也直接影響了蛹蟲草大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化.本試驗擬就溫度對蛹蟲草生長的影響規(guī)律進行系統(tǒng)研究, 以期為蛹蟲草子座的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的環(huán)境控制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

供試的蛹蟲草菌種CM1和CM2采自西安宏生蟲草專業(yè)合作社，經(jīng)由陜西科技大學(xué)微生物實驗室分離并經(jīng)子座分化實驗后備用；CDM-003由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物教研室提供.

1.1.2 原料

主要原料包括小麥、葡萄糖、蛋白胨、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和維生素B1.

1.1.3 儀器

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠) , SW -CJ-1F 超凈工作臺( 蘇州凈化設(shè)備有限公司) , MJ-160型霉菌培養(yǎng)箱，HYG-IIa迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司)，其他為一般常規(guī)設(shè)備工具.

1.1.4 培養(yǎng)基

在栽培容器( 400 mL罐頭瓶) 中，加入28 g小麥+2 g蠶蛹粉+45 mL的營養(yǎng)液.其中，營養(yǎng)液配方：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5 g，硫酸鎂(MgSO4) 0.5 g，VB12片，水1 000 mL，pH 自然.培養(yǎng)基配制：混合均勻，置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃下滅菌60～80 min，冷卻后備用.

1.1.5 菌種活化

將試驗菌種接入PDA培養(yǎng)基中, 置于25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，菌絲長滿斜面，將活化菌種接入120 mL/250 mL錐形瓶中(葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.05%)，在 25 ℃、160 r/ min 搖床震蕩培養(yǎng)，制備液體菌種備用.

1.2 試驗方法

培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶中滅菌后冷凝，每瓶用無菌注射器接種菌液5 mL.將菌絲從接種到子座成熟分為發(fā)菌、轉(zhuǎn)色、子座分化和子座生長等4個階段，除試驗階段在不同的溫度(16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃)下培養(yǎng)外，其余階段培養(yǎng)溫度均為23 ℃，光照用燈為熒光燈，空氣濕度控制在80%～90%.觀察并記錄菌體生長情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對發(fā)菌的影響

由表1可知，當溫度為24 ℃時，CM1、CM2、CDM-003發(fā)菌所需的時間分別為30 h、30 h、24 h，比16 ℃時的發(fā)菌時間分別要低10 h、6 h、12 h，表明24 ℃時最有利于菌種的發(fā)菌.在20～28 ℃時，菌絲鋪滿培養(yǎng)瓶表面所需的時間為8～10 d，菌絲的長勢(密度、色澤等)也較好.此時，3種不同的菌株間的表現(xiàn)差異也不大.但在16 ℃時，鋪瓶時間分別為13 d、13 d、10 d，延長了2～4 d，此時菌絲的長勢較為稀疏，表明低溫不利于縮短生產(chǎn)周期.表1也同時表明，20～28 ℃應(yīng)為菌絲生長的最適溫度，但在20 ℃時，子座的鮮產(chǎn)量相較與24 ℃和28 ℃時卻為最大，平均多產(chǎn)2～5 g，表明雖然生長的最適溫度是指生長最快的溫度，但這并不是菌株生長最健壯的溫度.因為在最適溫度下，菌絲體內(nèi)的有機物消耗過多，子座反倒長得細長柔弱.因此在生產(chǎn)實踐上培育健壯菌株，溫度常常應(yīng)低于最適溫度.因此，在生產(chǎn)實踐中，選取20 ℃時發(fā)菌，有利于獲得最大子座鮮重.

表1 溫度對菌絲體生長的影響

2.2 溫度對菌絲轉(zhuǎn)色的影響

隨著時間的推移，生理成熟的蛹蟲草菌絲體最初可在料面、料與容器間隙聚集扭結(jié)成肉眼隱約可見似蠶卵的團狀物，這種團狀物為原基的前身，即菌絲團[6].菌絲團顏色一般同其著生處菌絲體顏色一致，呈橙黃、橙色或橙紅色，這一階段也稱為轉(zhuǎn)色階段.實驗結(jié)果如表2所示，不同的溫度對CM1、CM2完成轉(zhuǎn)色所需的時間及色澤、轉(zhuǎn)色狀況等影響不大，但卻對CDM-003有顯著的影響，16 ℃和28 ℃的溫度下，其轉(zhuǎn)色狀況為差和很差.表2也同時表明，20 ℃時不同的菌株均能獲得較大的子座鮮重.

表2 溫度對菌絲轉(zhuǎn)色的影響

圖1 20 ℃時CM1、CM2、CDM-003菌株的轉(zhuǎn)色情況

2.3 溫度對子座分化的影響

待菌絲完全轉(zhuǎn)色后，菌絲團內(nèi)部組織分化，則變成較堅實的小刺尖狀，即小原基，原基的形成對子座的生成至關(guān)重要，因此，考慮到其生長的原生態(tài)環(huán)境，可通過8～10 ℃的溫差刺激原基的形成.原基的顏色同著生處的菌絲體顏色一致.小原基經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)，即逐漸膨大，并開始組織分化，長成頂端上呈白色、頂端下呈橙黃色或橙色、橙紅色的尖錐狀的小子座.實驗結(jié)果表明，在20 ℃時的子座分化情況最好,如圖2所示.

圖2 20 ℃時CM1、CM2、CDM-003菌株的子座分化情況

2.4 溫度對子座生長和子實體生成的影響

小子座經(jīng)培養(yǎng)后變粗伸長，頂端白色消失，從而進入子座正常穩(wěn)定的成長階段. 進入正常穩(wěn)定生長階段的子座，在其培養(yǎng)后期一般就不再增粗伸長，頭部膨大呈棒形，頂端呈鈍圓或扁圓形，也有呈葉尖形的.子座的上部略小，呈長圓柱形或扁圓形，有的柄中間具明顯縱陷紋，全株呈橙色或橙紅色.進入成熟階段的子座，其柄一般不再增粗伸長，有些由于包裹在其內(nèi)的子囊殼伸長頂端外露的緣故，頂端出現(xiàn)乳頭狀小突起，還有些，由于彈射孢子緣故，在其背部會呈現(xiàn)龜背狀花紋.至此子座完全成熟，其形狀、顏色與成長階段基本相同.實驗結(jié)果如表3所示.

表3 溫度對子座生長和子實體生成的影響

由表3可以看出，蛹蟲草子座生長溫度為 28℃ 時, 子座成熟很快, 一般 48～ 57 d 就可采收, 但子座短小、多畸變，平均株高與20 ℃時相比下降了1.2～1.7 cm，子座鮮重下降了5～6 g，商品性也差；當生長溫度為 20～24 ℃時，子座生長適度, 可維持生長期 56～ 68 d, 形成的子座粗而長, 產(chǎn)量高, 商品性好.當溫度低于20 ℃時，子座不易形成子囊孢子，推遲了成熟時間，延長了子囊座的生長期，增加了成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中不利于降低生產(chǎn)成本.表3還表明，CDM-003成熟所需的時間明顯低于CM1和CM2，但是其每瓶子座的鮮重也略低于后兩者，猜想認為是由種間差異所致.

圖3 24 ℃時CM1、CM2、CDM-003菌株的子座生成情況

3 結(jié)論

蛹蟲草屬于中偏低溫、變溫結(jié)實型真菌, 高溫不利于蛹蟲草的生長繁殖.因此，在人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體時，根據(jù)蛹蟲草對溫度的要求，可分春、秋兩季栽培.適宜的播種時間由兩個條件決定：一是接種期在當?shù)匮骄鶜鉁夭怀^24 ℃；二是從接種時往后推1個月為子座分化期，當?shù)匮骄鶜鉁夭坏陀?6 ℃.春季一般安排在3月上旬種植，秋季在10月上旬完成.立秋過后，氣溫由高轉(zhuǎn)低，晝夜溫差過大，正好有利于子座分化，是栽培的最佳季節(jié).在進行工廠化連續(xù)生產(chǎn)時必須有良好的溫度控制措施.

本研究結(jié)果表明，蛹蟲草菌絲生長對溫度十分敏感，即微小的溫度變化就會引起較大的生理效應(yīng).從實驗可知，蛹蟲草菌絲發(fā)菌的最佳溫度為20 ℃.但從蛹蟲草菌絲長勢來看，20～ 24 ℃培養(yǎng)的菌絲長勢最好，氣生菌絲旺盛、濃密、潔白、易于轉(zhuǎn)色.因為在生長溫度較低時, 菌絲的生長速率雖有所降低，但分枝較多，單位栽培料中的菌絲量增加，生長旺盛，對提高后期子座產(chǎn)量十分有利.但當溫度過低時，發(fā)菌期較長，對設(shè)備的利用率有一定影響.因此在進行蛹蟲草工廠化栽培時, 要合理調(diào)節(jié)菌絲體培養(yǎng)溫度, 在不影響產(chǎn)量的前提下, 盡量縮短生產(chǎn)周期, 提高經(jīng)濟效益.

蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色的最適溫度為20 ℃, 高溫和低溫都不利于轉(zhuǎn)色.一般情況下，轉(zhuǎn)色后的菌體，都能分化子座，但有些原因也造成轉(zhuǎn)色后的菌體不能形成正常子實體，表現(xiàn)為：①料面不分化原基，僅在菌體周圍貼瓶形成不規(guī)則的爬璧菌索.②原基分化密集，相互粘連，繼而形成厚而堅實的菌絲組合體，不形成正常子座.③子座分化稀疏，呈線狀倒伏，或子實體短小紡錘形.形成這些的原因可能是：①栽培季節(jié)選擇不當，菌體轉(zhuǎn)色后遇連續(xù)低溫或高溫的環(huán)境條件，使成熟的菌體轉(zhuǎn)入生殖生長后，在高于或低于原基分化溫度的情況下，由于基內(nèi)營養(yǎng)的不斷輸送供給，而在表層形成堅硬的菌核，在周圍形成爬璧菌索.②使用劣質(zhì)菌種，種性較差.因此在進行規(guī)?；a(chǎn)時, 一定要控制好菌絲轉(zhuǎn)色溫度和選擇優(yōu)良的菌種.在生產(chǎn)中, 菌種的質(zhì)量也是影響轉(zhuǎn)色的重要因素, 優(yōu)良的菌種只要溫度適宜都能轉(zhuǎn)色，但轉(zhuǎn)色時間和轉(zhuǎn)色效果是影響蛹蟲草子座產(chǎn)量的關(guān)鍵, 與子座分化的數(shù)量和時間有很大關(guān)系.適時轉(zhuǎn)色的蛹蟲草，子座形成早、數(shù)量多、產(chǎn)量高，反之子座形成時間推遲、數(shù)量少、產(chǎn)量低.轉(zhuǎn)色困難的菌種一般難以形成子座，即使能形成子座產(chǎn)量也很低.綜上所述，蛹蟲草對溫度比較敏感，不同的生長階段對溫度要求不同，在生產(chǎn)中適宜于分階段變溫管理.

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