孫艷俠，王國干，崔小岱，高鑫，孫春榮

曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠的保護作用及其機制

孫艷俠，王國干，崔小岱，高鑫，孫春榮

目的:觀察曲美他嗪對M株柯薩奇病毒B3(CVB3m)感染的病毒性心肌炎小鼠的保護作用并探討其可能作用機制。

方法:以CVB3m誘導的病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型為研究對象。201只清潔級近交系4～6周齡雄性Balb/c小鼠隨機分成5組。正常對照小鼠20只(正常組);病毒性心肌炎小鼠55只(心肌炎組);喂養(yǎng)曲美他嗪10 mg/(kg·d)的正常小鼠20只(藥物對照組);喂養(yǎng)曲美他嗪10 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(低劑量治療組);喂養(yǎng)曲美他嗪20 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(高劑量治療組)。觀察各組血清中肌鈣蛋白I(cTnI)水平、血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的變化以及心肌組織中FasmRNA表達水平的變化。

結(jié)果:小鼠感染CVB3m后第7天及第14天，與正常組及藥物對照組比較，心肌炎組、低劑量治療組和高劑量治療組血清cTnI水平、MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低，F(xiàn)asmRNA的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。小鼠感染CVB3m后第7天，與心肌炎組比較，低劑量治療組和高劑量治療組血清cTnI水平顯著降低，MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與心肌炎組及低劑量組比較，高劑量治療組SOD含量顯著升高，F(xiàn)asmRNA的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。感染CVB3m后第14天，與心肌炎組比較，低劑量治療組和高劑量治療組血清cTnI水平、MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，F(xiàn)asmRNA的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與低劑量治療組比較，高劑量治療組上述指標變化更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

結(jié)論:曲美他嗪能夠減少病毒性心肌炎中心肌細胞的損害。其機制可能與其抗氧化作用以及通過下調(diào)FasmRNA水平抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。

心肌炎;曲美他嗪;氧自由基;凋亡;Fas

(Chinese Circulation Journal，2012，27:224.)

病毒性心肌炎(VMC)是由病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性炎癥。最常見的病原是柯薩奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)。近年來病毒性心肌炎的死亡率并沒有得到根本改變。因此尋找病毒性心肌炎有效治療藥物已經(jīng)成為當前病毒性心肌炎防治研究的重要內(nèi)容。曲美他嗪(trimetazidine)是一種新的促進心肌能量代謝的藥物，目前已用于缺血性心臟病的治療［1］。但曲美他嗪在治療病毒性心肌炎方面的作用機制并不十分清楚，這方面的基礎(chǔ)研究較少。本實驗研究曲美他嗪對M株CVB3(CVB3m)病毒性心肌炎小鼠心肌的保護作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

材料:①實驗動物:2011-06至2011-07選擇4～6周齡，體重16～18 g左右，近交系雄性Balb/c小鼠201只(由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，二級實驗動物，動物合格證號:SCXK(京)2006-0009。本動物實驗方案通過中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院實驗動物福利與倫理審查委員會審查。②病毒:柯薩奇B3親心肌株病毒(首都兒科研究所提供)。病毒在本實驗室經(jīng)Hela細胞和乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞中傳代馴化、滴定。最終使用濃度為 1×103PFU/ml(PFU:空斑形成單位)。③主要試劑與儀器:鹽酸曲美他嗪片(商品名:萬爽力)，為施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)，批號:國藥準字 H20055465。丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)測試試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，分光光度計(UNICO，UV-2000，中國，上海)。小鼠肌鈣蛋白I(cTnI)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(購自RB公司，貨號2R607s)，全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo，美國)。Trizol(Invitrogen公司，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］，SYBR GreenⅠ熒光染料(KAPA Biosystem公司，美國)，引物(上海生工公司合成)，實時定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(ROCHE Light-Cycler480，美國)。

方法:①實驗分組及治療方法:將201只小鼠隨機分為5組:正常對照小鼠20只(正常組);病毒性心肌炎小鼠55只(心肌炎組);喂養(yǎng)曲美他嗪 10 mg/(kg·d)的正常小鼠20只(藥物對照組);喂養(yǎng)曲美他嗪10 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(低劑量治療組);喂養(yǎng)曲美他嗪20 mg/(kg·d)的病毒性心肌炎小鼠53只(高劑量治療組)。心肌炎組，低劑量治療組，高劑量治療組腹腔單次接種1×103PFU/ml CVB3m制作病毒性心肌炎小鼠模型，0.4 ml/只;正常組和藥物對照組小鼠腹腔注射相同劑量不含病毒的Eagel’s培養(yǎng)液0.4 ml/只。注射病毒當天為第0天，從第3天開始藥物對照組和低劑量治療組開始給予曲美他嗪10 mg/(kg·d)，高劑量治療組給予曲美他嗪20 mg/(kg·d)，正常組和心肌炎組給予等體積飲用水，灌胃給藥，連續(xù)用藥2周。②標本留取:各組實驗小鼠在腹腔注射病毒后，分別于第7天、14天每組分別處死6～9只小鼠，稱重后眼球取血，離心后，將血清分裝凍存;處死小鼠并留取心臟:將心臟用冰生理鹽水洗滌2次，濾紙吸干，切成小塊分裝投入液氮中凍存，待做熒光定量PCR以及其他檢測。③觀察指標a:血清中cTnI的含量:免疫吸附測定(ELISA)法檢測，按試劑盒說明書。b:血清中超氧化物歧化酶，丙二醛含量:采用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶活性，采用硫代巴比妥酸法測丙二醛含量。按試劑盒提供的操作流程進行。c:心肌組織Fas mRNA的水平:Real-timePCR法。根據(jù)Gen-Bank序列號合成小鼠Fas和內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列。Fas引物序列:上游:5'-AGCCATGAAGAGAGGAGAGAGC-3'，下 游:5'-CCTGGAACCTGCTAGTCATTTG-3'。GAPDH 引 物 序 列:上 游:5'-CAACTCCCACTCTTCCACCTTC-3'，下 游:5'-TCTCTTGCTCAGTGTCCTTGCT-3'。采用 Trizol法提取心肌總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測所得總RNA的純度和濃度。用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，PCR的反應體系為20μl體系，包括 DEPC處理水8.2μl，上、下游引物各 0.4 μl、SYBR GREENⅠ 10μl，cDNA 1 μl。反應條件:95℃ 3 min;95℃ 3 s，60℃ 20 s，72℃ 1 s;40℃ 1 min 45個循環(huán)。用2-△△Ct法分析目的基因相對表達量。結(jié)果重復3次。

統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，計數(shù)資料用均數(shù)±標準差，多組間比較用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法，方差不齊者進行Dunnett’s T3檢驗，顯著性檢驗水準α=0.05。全部資料用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果

曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠血清肌鈣蛋白I含量的影響:免疫吸附測定結(jié)果顯示病毒接種后第7天及第14天，與正常組和藥物對照組比較，心肌炎組，低劑量治療組和高劑量治療組血清cTnI含量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與心肌炎組比較，低劑量治療組和高劑量治療組血清cTnI水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與低劑量治療組比較，高劑量治療組血清cTnI水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。圖1

圖1 各組小鼠血清中肌鈣蛋白I水平。與A和C組比較*P＜0.05;與 B組比較△P＜0.05;與 D組比較 ▲P＜0.05。A:正常組(n=5);B:心肌炎組(n=6);C:藥物對照組(n=5);D:低劑量治療組(n=6);E:高劑量治療組(n=6)

曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影響:小鼠感染CVB3m后第7天，與正常組和藥物對照組比較，心肌炎組，低劑量治療組和高劑量治療組血清中超氧化物歧化酶含量有明顯下降(P＜0.05)，丙二醛含量明顯升高(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。與心肌炎組及低劑量治療組比較，高劑量治療組超氧化物歧化酶含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與心肌炎組比較，高劑量治療組及低劑量治療組丙二醛含量明顯下降，與低劑量治療組比較，高劑量治療組丙二醛含量明顯下降更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。病毒感染后第14天，與正常組和藥物對照組比較，心肌炎組、低劑量治療組和高劑量治療組血清中超氧化物歧化酶含量明顯下降(P＜0.05)，丙二醛含量明顯升高(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。與心肌炎組比較，低劑量治療組和高劑量治療組超氧化物歧化酶含量明顯升高(P＜0.05)，丙二醛含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與低劑量治療組比較，高劑量治療組超氧化物歧化酶含量升高更明顯(P＜0.05)，丙二醛含量下降更明顯(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義，表1。

曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠心肌組織FasmRNA表達的影響:FasmRNA的熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:小鼠感染CVB3m后第7天及第14天，與正常對照組及藥物對照組比較，心肌炎組，低劑量治療組和高劑量治療組FasmRNA顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。感染后第7天，與心肌炎組，低劑量治療組比較，高劑量治療組FasmRNA的表達有所減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。感染后第14天，與心肌炎組比較，高劑量治療組和低劑量治療組FasmRNA的表達較心肌炎組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與低劑量治療組比較，高劑量治療組使心肌組織中FasmRNA的表達下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。圖2

曲美他嗪藥物對照組在整體發(fā)病情況、血清cTnI、超氧化物歧化酶、丙二醛檢測、心肌組織中FasmRNA檢測顯示:曲美他嗪藥物對照組與正常組無明顯差異。

表1 曲美他嗪對各組小鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影響(±s)

表1 曲美他嗪對各組小鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛含量的影響(±s)

注:與正常組及藥物對照組比較 *P＜0.05;與心肌炎組比較 △P＜0.05;與低劑量治療組比較 ▲P＜0.01

組別 例數(shù)超氧化物歧化酶(U/ml)7 d 14 d丙二醛(nmol/ml)7 d 14 d正常組 5 158.24±5.88 163.38±6.58 4.56±0.64 4.73±0.44心肌炎組 8 119.21±6.59* 134.68±3.29* 10.05±1.32* 8.94±1.16*藥物對照組 5 159.36±10.09 160.78±7.24 4.63±1.14 5.03±0.56低劑量治療組 8 126.41±10.63* 142.75±3.45＊△ 7.90±1.40＊△ 7.32±1.02＊△高劑量治療組 8 139.29±8.79＊△▲ 149.90±4.38＊△▲ 7.40±0.37＊△▲ 6.31±0.72＊△▲

圖2 熒光定量PCR檢測小鼠心肌組織中FasmRNA表達變化。與A和C組比較 *P＜0.05;與B組比較△P＜0.05;與 D 組比較▲P＜0.05。A:正常組(n=5);B:心肌炎組(n=6);C:藥物對照組(n=5);D:低劑量治療組(n=6);E:高劑量治療組(n=6)

3 討論

病毒性心肌炎是各種病毒感染所致以心肌細胞炎性浸潤、變性壞死或間質(zhì)水腫，伴有明顯的心肌代謝障礙和心功能改變的心血管疾病，晚期可進展為擴展型心肌?。?］。研究表明病毒性心肌炎時體內(nèi)抗氧化酶活性降低，自由基生成增加而清除減少，過氧化應激加重心肌損傷是其重要的發(fā)病機制［3，4］。丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應的中間產(chǎn)物，直接反映體內(nèi)自由基損害。超氧化物歧化酶是體內(nèi)一種重要的自由基清除酶，自由基的過量產(chǎn)生可使超氧化物歧化酶損耗增加，從而使其體內(nèi)活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染各組小鼠血清丙二醛含量明顯升高而超氧化物歧化酶活性卻相應的降低。曲美他嗪是線粒體酶一長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶(3-KAT)抑制劑，具有優(yōu)化心肌細胞能量代謝作用，使能量代謝在缺血狀態(tài)下從脂肪的氧化轉(zhuǎn)移到葡萄糖的氧化，使心臟ATP生產(chǎn)效率增加，使心肌細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生減少，減輕心肌細胞內(nèi)酸中毒，穩(wěn)定缺血、缺氧心肌細胞，保護線粒體、溶酶體，保護心肌細胞，使左心室收縮功能得到顯著改善［5，6］。本實驗結(jié)果顯示，使用TMZ保護后血清丙二醛含量較正常組顯著降低，超氧化物歧化酶活性明顯升高，說明TMZ能降低病毒性心肌炎發(fā)病過程中丙二醛的含量，對心肌缺血性損傷提供保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡在病毒性心肌炎發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，尤以發(fā)病早期心肌細胞凋亡最明顯［7，8］。細胞毒T淋巴細胞(CTL)介導的細胞毒作用是病毒性心肌炎心肌細胞損傷的主要原因，F(xiàn)as途徑是CTL致靶細胞損傷的主要途徑之一。當激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)經(jīng)Fas/FasL與靶細胞結(jié)合時，便可將凋亡信號轉(zhuǎn)入后者，使靶細胞在數(shù)小時內(nèi)發(fā)生凋亡［9］。本研究結(jié)果顯示病毒感染后心肌組織中FasmRNA水平顯著上調(diào)。可以證實病毒性心肌炎小鼠心肌組織中存在Fas介導的細胞凋亡。而曲美他嗪干預后，心肌組織中FasmRNA水平顯著降低。說明適當劑量的曲美他嗪可以抑制細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制Fas表達有關(guān)。

病毒感染導致心肌損傷，心肌細胞破壞使cTnI釋放進入外周血［10］。本試驗中，病毒感染后，小鼠血清cTnI的含量較正常組明顯增高，提示有持續(xù)的心肌損害。提示:cTnI可以作為CVB3m致病毒性心肌炎的生物標志物。曲美他嗪干預后，cTnI降低顯著。表明曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠的心肌有保護作用。曲美他嗪藥物對照組與正常組無明顯差異。說明曲美他嗪在本實驗中對正常動物的心肌細胞，F(xiàn)as水平無明顯調(diào)節(jié)作用。綜上所述，曲美他嗪可能通過抗氧化作用以及對Fas途徑的干預，對病毒性心肌炎起保護作用。

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(編輯:汪碧蓉)

Protective Effect and Mechanism of Trimetazidine on Viral Myocarditis in Mice Model

SUN Yan-xia，WANG Guo-gan，CUIXiao-dai，GAO Xin，SUN Chun-rong.Department of Cardiology，Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing(100037)，China Corresponding Author:WANG Guo-gan，Email:wangguog@263.net

Objective:To observe the protective effect and mechanism of trimetazidine on viralmyocarditis inmicemodel.

Methods:A total of201 malemice were randomly divided into 5 groups.Normal control group，n=20，Myocarditis group，n=55，themyocarditis was induced by Coxsackievirus B3(CVB3);Trimetazidine control group，n=20，the normalmice were fed with trimetazidine 10mg/(kg·d)，Low dose group，n=53，myocarditismice were treated with trimetazidine 10 mg/(kg·d)and High dose group，n=53，myocarditismicewere treated with trimetazidine20mg/(kg·d).Effectof trimetazidine on serum levels of cardiac troponin I(cTnI)，super oxide dismutase(SOD)and maleic dialdehyde(MDA)were examined and Fas mRNA expression in myocardium was analyzed by real-time PCR.

Results:At7 and 14 days after CVB3 infection，compared with Normal control and Trimetazidine control groups，the serum levels of cTnI，MDA and Fas mRNA expression increased，SOD decreased in Myocarditis，Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.At7 days after infection，compared with Myocarditis group，cTnI and MDA decreased in Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.Compared with Myocarditis and Low dose groups，SOD increased，F(xiàn)as mRNA decreased in High dose group，P＜0.05 respectively.At 14 days after infection，compared with Myocarditis group，SOD increased，cTnI，MDA and FasmRNA expression decreased in Low dose and High dose groups，P＜0.05 respectively.

Conclusion:Trimetazidine could decrease themyocardium injury inmyocarditismicemodel，thismight be because of its antioxidant activity and the inhibition of FasmRNA expression.

Myocarditis;Trimetazidine;Oxyradical;Apoptosis;Fas

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 阜外心血管病醫(yī)院 急重癥中心(孫艷俠、王國干、高鑫);首都兒科研究所中心實驗室(崔小岱、孫春榮)

孫艷俠 碩士研究生 主要從事心血管內(nèi)科研究 Email:1sunyanxia@sina.com 通訊作者:王國干 Email:wangguog@263.net

R972.4

A

1000-3614(2012)03-0224-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2012.03.020

2011-10-13)

·基礎(chǔ)與實驗研究·