周小年 藍(lán)文 覃志偉 李紅斌

耐頭孢菌株的糖尿病腎病臨床特點(diǎn)的研究

周小年 藍(lán)文 覃志偉 李紅斌

目的 研究耐頭孢他啶的糖尿病腎病患者對(duì)β-內(nèi)酰胺酶(EsBIJs)攜帶情況及對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況。方法 篩選出耐頭孢他啶的菌株，PCR擴(kuò)增基因TEM、SHV、CTX-M。進(jìn)而進(jìn)行對(duì)頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙殺星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦和亞胺培南的藥敏性檢驗(yàn)。結(jié)果 有89%糖尿病腎病患者出現(xiàn)耐頭孢他啶的情況，在耐頭孢他啶菌株中有68%表現(xiàn)產(chǎn)ESBLs陽性菌對(duì)頭孢類抗生素高度耐藥，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙殺星的耐藥率為69% ～88%，對(duì)頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20%～30%，對(duì)亞胺培南高度敏感(100%)。結(jié)論 耐頭孢他啶的糖尿病腎病患者易攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因，并表現(xiàn)多重耐藥性。

糖尿病腎病;頭孢菌素;ESBLs;亞胺培南

糖尿病及其慢性并發(fā)癥已嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。近年來，糖尿病發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢(shì)。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭的首位疾?。?］。在糖尿病腎病的臨床治療中，第3代頭孢菌素的使用呈逐年上升的趨勢(shì)，這是由于第3代頭孢菌素類藥物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，血漿消除半衰期內(nèi)分布廣，組織穿透力強(qiáng)，對(duì)腎臟基本無毒性，且制劑類多，選擇種類較多，適合各年齡段患者，始終是應(yīng)用中的首選［2］。隨著三代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，糖尿病腎病患者易發(fā)生產(chǎn)ESBIJs菌的耐藥問題，所以臨床分離產(chǎn)ESBIJs細(xì)菌對(duì)指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素、抑制新產(chǎn)生的耐藥菌等均有十分重要的意義［3］。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)頭孢菌素類藥物耐藥的DN患者進(jìn)行觀察，分析耐藥機(jī)制，同時(shí)探討其臨床特點(diǎn)，并提出合理的治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取1年以上使用第三代頭孢菌素的300位糖尿病腎病患者為研究對(duì)象，收集患者血液和尿液，放在水解酪蛋白胨(M-H)瓊脂培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司。然后挑取菌落，制備菌株。

1.2 抗生素紙片 頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 耐頭孢他啶的藥敏實(shí)驗(yàn) 將從患者體內(nèi)分離的菌株，用抗菌藥物紙片擴(kuò)散法即K-B法和MIC法測(cè)定對(duì)頭孢他啶的藥敏情況。將菌株對(duì)頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤15 mm或MIC≥6μg/ml的菌株，歸為不敏感菌株。

1.4 ESBIJs篩選試驗(yàn) 雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)，參照NCCLS(2009年版)，按常規(guī)紙片擴(kuò)散法在M-H上涂好菌株。先在平板中心貼阿莫西林紙片，然后在其上下左右貼CAZ、ATM、FTX、FEP，周圍紙片距中心紙片距離25 mm，35℃孵育18～20 h。如周圍4個(gè)藥敏中有任何一個(gè)與阿莫西林有協(xié)同作用為ESBIJs陽性菌株。

TEM基因PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，然后94℃lmin，55℃ 1 min，72℃ l min，30 個(gè)循環(huán)，再 72℃10 min。SHV基因PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，退火 68℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，再72℃10 min。CTX一M基因PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性3 min，然而94℃ 45 s，56℃45 s、72℃1 min，32 個(gè)循環(huán)，再 72℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.6 對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況 對(duì)表型為ESBIJs陽性菌株，分別進(jìn)行對(duì)常見藥物亞胺培南、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏試驗(yàn)，方法如同耐頭孢他啶的藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.7 儀器FQD-33A熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)購自杭州博白公司。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耐頭孢他啶菌株陽性率 用抗菌藥物紙片擴(kuò)散法即KB法和MIC法測(cè)定從患者體內(nèi)分離的菌株對(duì)頭孢他啶的藥敏情況。發(fā)現(xiàn)在300例患者中有267例，即89%的DN患者均對(duì)頭孢他啶耐藥。

表1 患者耐頭孢他啶菌株陽性率(例，%)

2.2 TEM、SHV、CTX一M基因PCR檢測(cè)結(jié)果 在267例耐頭孢他啶的DN患者，進(jìn)行產(chǎn)ESBIJs陽性菌的篩選。為了進(jìn)一步的確認(rèn)產(chǎn)ESBIJs陽性菌。用PCR擴(kuò)增ESBIJs酶中常見的3種TEM、SHV、CTX-M 基因，TEM和SHV基因擴(kuò)增均出現(xiàn)相同條帶(1 074 bp)，CTX一M基因出現(xiàn)217 bp清晰明亮產(chǎn)物帶。發(fā)現(xiàn)TEM、SHV、CTX-M基因的檢出率分別為52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同時(shí)檢測(cè)到2種以上基因型。見圖1～3。

圖1 TEM基因1074 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

圖2 SHV基因1074 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

圖3 CTX-M基因217 bp片段瓊脂凝膠電泳圖

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，產(chǎn)ESBIJs菌對(duì)頭孢類抗生素高度耐藥，對(duì)慶大霉素、環(huán)丙殺星的耐藥率為69% ～88%，對(duì)頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20% ～30%，對(duì)亞胺培南高度敏感(100%)，產(chǎn)ESBIJs菌表現(xiàn)出多重耐藥性，除了對(duì)亞胺培南的耐藥率很低以外，對(duì)其常見的抗生素均表現(xiàn)耐藥交叉性。

表2 產(chǎn)ESBIJs菌對(duì)常見抗生素的耐藥率(例，%)

3 討論

糖尿病腎病DN是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，DN的發(fā)病是多因素綜合作用的結(jié)果。近年來，由于廣譜頭孢菌素在糖尿病腎病臨床治療中的廣泛應(yīng)用，患者對(duì)頭孢菌素的耐藥率有增加的趨勢(shì)。如何合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的毒副作用，減少二重感染及細(xì)菌耐藥性的發(fā)生，一直備受廣大臨床工作者的關(guān)注。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(EsBIJs)，能水解包括三代頭孢菌素、單環(huán)酰酶胺類抗生素和四代頭孢菌素等含1個(gè)氧亞氨基基團(tuán)側(cè)鏈的β-內(nèi)酰胺(0xyimino B-lactam)類抗生素，但可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(克拉維酸)等抑制。所以本實(shí)驗(yàn)首先篩選出耐頭孢他啶的DN患者。發(fā)現(xiàn)在300例患者中有267例，即89%的DN患者均對(duì)頭孢他啶耐藥。

ESBIJs耐藥基因種類較多，包括TEM型、SHV型、CTXM型等，其中以TEM和SHV型為主，但在中國以CTX-M型為主。本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的耐頭孢他啶的患者進(jìn)行ESBIJs表型及其基因分析。通過ESBIJs篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)267例患者中，有187例，即70%的患者表現(xiàn)ESBIJs陽性特征。然后通過PCR擴(kuò)增TEM、SHV、CTX一M基因，進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)ESBIJs的陽性患者［5］。發(fā)現(xiàn) TEM、SHV、CTX-M 基因的檢出率分別為52.3%、43.3%和68.7%。有72株菌株同時(shí)檢測(cè)到2種以上基因型。見圖1～3。

然后對(duì)ESBIJs表型陽性的菌株進(jìn)行其他常見抗菌藥物的藥敏檢驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，產(chǎn)ESBIJs菌對(duì)頭孢類抗生素高度耐藥對(duì)慶大霉素、環(huán)丙殺星的耐藥率為69%-88%，對(duì)頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為20%-30%，對(duì)亞胺培南高度敏感(100%)，產(chǎn)ESBIJs菌表現(xiàn)出多重耐藥性，除了對(duì)亞胺培南的耐藥率很低以外，對(duì)其常見的抗生素均表現(xiàn)耐藥交叉性。因?yàn)镋SBIJs常位于質(zhì)粒上，可以從一個(gè)細(xì)菌傳遞到另一個(gè)細(xì)菌，甚至在不同的菌種之間傳遞［6］。因此，產(chǎn)ESBIJs細(xì)菌的耐藥性與攜帶多個(gè)耐藥基因的質(zhì)粒、ESBIJs基因型及細(xì)菌本身固有的耐藥機(jī)制有關(guān)。產(chǎn)ESBIJs細(xì)菌常表現(xiàn)出對(duì)多種抗菌藥物的同時(shí)耐藥，常同時(shí)對(duì)第三代頭孢菌素，喹諾酮類及氨基糖苷類藥物耐藥。而碳青霉烯類抗生素，包括亞胺培南、美洛培南等，在體內(nèi)與體外對(duì)ESBIJs都高度穩(wěn)定，是治療產(chǎn)ESBIJs菌株嚴(yán)重感染療效確切的一類藥物［7］。喹諾酮類藥物耐藥基因常位于染色體上，最近研究顯示喹諾酮類藥物耐藥基因和ESBIJs編碼基因可位于同一個(gè)可轉(zhuǎn)移性的質(zhì)粒上。產(chǎn)ESBIJs細(xì)菌的質(zhì)粒上還往往連鎖攜帶了耐氯霉素、磺胺類、四環(huán)素、氨基糖苷類等的耐藥基因［8］。

如何合理使用抗菌藥物，盡可能減少抗菌藥物的毒副作用，減少二重感染及細(xì)菌耐藥性的發(fā)生，一直備受廣大臨床工作者的關(guān)注［9］。隨著三代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)ESBIJs菌引起的耐藥問題越來越嚴(yán)重，對(duì)臨床分離產(chǎn)ESBIJs細(xì)菌的監(jiān)測(cè)成為臨床微生物檢驗(yàn)十分重要的內(nèi)容，對(duì)指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素、有效治療革蘭陰性菌引起的嚴(yán)重感染性。疾病、醫(yī)院內(nèi)感染的控制、抑制新產(chǎn)生的耐藥菌等均有十分重要的意義。

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415000 湖南省常德市石門縣人民醫(yī)院