程 念 胡進(jìn)中 田玲玲 趙欣欣 申軍華 李芳芳

(河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

脈絡(luò)寧對老年性癡呆模型大鼠腦組織SIRT1基因表達(dá)的影響

程 念 胡進(jìn)中 田玲玲 趙欣欣 申軍華 李芳芳

(河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的觀察中藥復(fù)方脈絡(luò)寧和謝海洲方，西藥維生素(C+E)和阿托伐他汀藥物干預(yù)對老年癡呆(AD)模型大鼠腦組織SIRT1基因表達(dá)的影響。方法用去卵巢同時腹腔注射D-半乳糖大鼠模擬早期AD模型，予以中藥復(fù)方脈絡(luò)寧和謝海洲方，西藥維生素(C+E)和阿托伐他汀干預(yù)，采用Morris水迷宮檢測大鼠用藥前后學(xué)習(xí)記憶能力的變化，采用RT-PCR，Western印跡技術(shù)檢測大鼠顳葉右側(cè)皮層SIRT1基因表達(dá)的變化。結(jié)果與假手術(shù)組相比，去卵巢并注射D-半乳糖組逃避潛伏期明顯延長;給藥后，與病理組相比，四個給藥組總逃避潛伏期明顯縮短。與假手術(shù)組相比，病理組的SIRT1mRNA和蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量明顯降低，而與病理組相比，四個給藥組的SIRT1mRNA和蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量均有不同程度的升高。結(jié)論本模型大鼠顳葉皮層SIRT1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低;而脈絡(luò)寧，謝海洲方，維生素(C+E)，阿托伐他汀均可以不同程度的升高SIRT1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，提示SIRT1表達(dá)的增加可能是這些藥物對AD大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用分子機(jī)制之一。

阿爾茨海默病;去卵巢;D-半乳糖;SIRT1;脈絡(luò)寧

多種因素可導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病，雌激素的缺乏被認(rèn)為是衰老女性觸發(fā)AD的原因之一，長期的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞炎癥和積累的損傷是AD發(fā)生發(fā)展的另一重要因素。研究表明，SIRT1能夠抑制AD模型鼠Aβ、病理斑塊的形成和認(rèn)知能力的下降〔1〕。本研究以去卵巢(OVX)+D-半乳糖(D-gal)雙重因素處理的大鼠來制備AD模型，選用中藥復(fù)方脈絡(luò)寧和謝海洲方，西藥維生素C+維生素E和阿托伐他汀觀察其對AD模型的SIRT1基因是否具有調(diào)節(jié)作用，從而為AD的預(yù)防和早期治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物 4月齡雌性SD大鼠48只，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號:710062。脈絡(luò)寧注射液(南京金陵制藥廠)，阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)，維生素C(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，維生素E膠丸(天津美通藥業(yè)有限公司)，中藥(石家莊樂仁堂)。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，2×Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Trizol(Solarbio公司)，PMSF(北京鼎國生物公司)，leupeptin(北京拜爾迪生物公司)，DTT(北京賽百盛生物公司)，GAPDH抗體和SIRT1抗體、ECL(Santa Cruz公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)，D-gal(New Jersey USA)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組 選用4月齡雌性SD大鼠48只，常規(guī)飼養(yǎng)2 w后隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組OVX組，其中假手術(shù)組8只、OVX組40只。應(yīng)用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對2組大鼠行腹腔內(nèi)麻醉，取俯臥位，選取大鼠髂前上棘靠頭部約1.5～2.0 cm，脊柱旁開約2.0 cm處，常規(guī)剪毛消毒、切開皮膚、分離肌肉、切開腹膜，OVX組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，夾出小網(wǎng)膜脂肪，分離雙側(cè)卵巢，小心結(jié)扎好卵巢動脈后切除卵巢。假手術(shù)組行同樣手術(shù)程序但僅切除少量小網(wǎng)膜脂肪組織(體積同卵巢大小)，然后依層關(guān)腹縫合。術(shù)后大鼠用標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。手術(shù)2 w后假手術(shù)組給予生理鹽水0.5 m l/d，腹腔注射;OVX組給予D-半乳糖 20 mg/d，腹腔注射。注射6 w后將OVX組再次隨機(jī)分為5組:脈絡(luò)寧組(ODM)，謝海洲方組(ODZ)，維生素(C+E)組(ODV)，阿托伐他汀組(ODA)及病理對照組(OD)，每組8只。各組均灌胃4 w，灌胃劑量如下:ODM組 脈絡(luò)寧注射液1.8 ml·kg－1·d－1，ODZ組 中藥復(fù)方16.83 g·kg－1·d－1，ODV 組 維生素 C 45 mg·kg－1·d－1，維生素 E 27 mg·kg－1·d－1，ODA 組 7.2 mg·kg－1·d－1，假手術(shù)組及OD組分別灌服蒸餾水1.5 ml·kg－1·d－1。灌胃過程中OVX組及假手術(shù)組繼續(xù)分別給予D-gal及生理鹽水注射。手術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)12 w后處死。

1.3.2 行為學(xué)測試 注射D-gal及生理鹽水4 w后，用Morris水迷宮對所有大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，每天4次，每次間隔5min，共4 d，作為學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練。注射D-gal及生理鹽水6 w后進(jìn)行Morris水迷宮測試，方法同上，測試1 d，以后三次逃避潛伏期的平均值作為評價大鼠記憶能力的指標(biāo)。動物處死前1 d，同樣條件水迷宮1 d，方法同上，記錄大鼠逃避潛伏期的平均值，作為評價大鼠空間記憶能力的指標(biāo)。

1.3.3 標(biāo)本的獲取 用戊巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉，剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，剝?nèi)★D葉右側(cè)皮層置液氮中，于－80℃低溫冰箱保存，用于組織總RNA及總蛋白的提取。

1.3.4 SIRT1 mRNA檢測 用Trizol法提取總RNA;RNA鑒定和定量;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);PCR反應(yīng);取目的基因和GAPDH的PCR產(chǎn)物各5μl，2%瓊脂糖凝膠電泳。用江蘇捷達(dá)凝膠成像分析系統(tǒng)照相得到目的基因與GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物的積分光密度值(I)，計算二者的比值(I目的基因/IGAPDH)，以此作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.5 SIRT1蛋白表達(dá)檢測 提取Lowry法測蛋白含量。采用Western印跡方法檢測SIRT1蛋白的相對含量。用凝膠成像分析儀采集圖像并用軟件進(jìn)行分析。GAPDH作內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均值的比較用單因素方差分析。經(jīng)檢驗各組方差齊，進(jìn)一步組間比較選用SNK多重比較檢驗。經(jīng)檢驗方差不齊，進(jìn)一步組間比較選用Dunnett T3多重比較檢驗。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的變化 各訓(xùn)練組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)增加而縮短，取最后三次逃避潛伏期的平均值進(jìn)行觀察，OVX+D-gal組逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組〔(8.7±4.1)vs(15.2±8.1)s，P＜0.05〕，提示雌激素缺乏同時注射D-gal會引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降;將各用藥組逃避潛伏期單獨與OD組進(jìn)行比較則無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是各組例數(shù)較少之故。若將ODM+ODZ+ODV+ODA組的例數(shù)相加，其逃避潛伏期明顯短于OD組〔(9.1±6.5)vs(16.7±12.3)s，P＜0.05〕，提示脈絡(luò)寧注射液，謝海洲方，維生素C+E，阿托伐他汀能改善去卵巢同時注射D-gal對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

2.2 SIRT1 mRNA水平的變化 與假手術(shù)組(0.624±0.030)相比，OD組(0.464±0.063)的SIRT1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與OD組相比，ODM組(0.968±0.127)、ODZ組(0.859±0.119)，ODV組(0.790±0.076)和 ODA組(0.603±0.091)的SIRT1 mRNA相對表達(dá)量均有不同程度的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中，以O(shè)DM組SIRT1 mRNA升高效果最明顯。見圖1。

2.3 SIRT1蛋白相對含量的變化 與假手術(shù)組(0.906±0.085)相比，OD組(0.581±0.199)SIRT1相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與 OD 組相比，ODM(2.023±0.288)組、ODZ組(1.818±0.287)、ODV 組(1.605±0.225)、ODA 組(1.033±0.091)的SIRT1相對表達(dá)量均有不同程度的增加(P＜0.05)，其中，以O(shè)DM組SIRT1升高效果最明顯。見圖2。

圖1 SIRT1 mRNA在大鼠顳葉右側(cè)皮層的表達(dá)

圖2 SIRT1蛋白在大鼠顳葉右側(cè)皮層的表達(dá)

3 討論

有各種證據(jù)表明SIRT1參與到神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、突觸可塑和學(xué)習(xí)記憶中〔2〕。SIRT1通過與不同的非組蛋白和組蛋白相互作用來完成不同的功能。SIRT1的激動劑白黎蘆醇可以使SIRT1的酶活性增加〔3〕，熱量限制可以使 SIRT1的表達(dá)增加〔4〕，一些小分子化學(xué)物質(zhì)可抑制 SIRT1的表達(dá)和酶的活性〔5〕，這些現(xiàn)象都說明SIRT1的表達(dá)是受到眾多因素影響的。脈絡(luò)寧注射液是由玄參、牛膝等中藥制成的復(fù)方靜脈滴注劑，具有滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)陰清熱，活血化瘀的功效，臨床常用于改善微循環(huán)的功能，對腦梗死及其后遺癥、腦供血不足和短暫性腦缺血發(fā)作及缺血導(dǎo)致的AD具有良好的預(yù)防和治療作用〔6〕。謝海洲方是中國中醫(yī)研究院謝海洲教授治療腦髓病的經(jīng)驗方〔7〕，方中重用黃芪補(bǔ)氣升陽;人參、白術(shù)、茯苓健脾益氣安神;佐以生地清熱涼血，養(yǎng)陰生津;當(dāng)歸、制首烏、枸杞子滋陰養(yǎng)血;山茱萸補(bǔ)益肝腎;巴戟天、淫羊藿、肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽，全方具有補(bǔ)腎健脾，填精養(yǎng)血，平補(bǔ)肝腎，益氣養(yǎng)腦的功效，常服可以改善記憶障礙，增強(qiáng)老年人記憶力。維生素C與維生素E都是臨床上常用的抗氧化劑，大劑量長時間給予維生素(C+E)能更好地降低AD病人體內(nèi)脂蛋白的氧化作用。膽固醇的增高也是AD的風(fēng)險因素，阿托伐他汀主要藥理作用是抑制膽固醇合成的限速酶HMG2CoA還原酶，從而降低膽固醇的生成，同時還具有抗氧化、抗炎癥、抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)等多種作用，可以減緩AD的發(fā)生發(fā)展〔8〕。本研究首次證實這4種藥物均可通過上調(diào)SIRT1的表達(dá)而對抗AD的發(fā)生發(fā)展的作用，其上調(diào)SIRT1表達(dá)的機(jī)制不清。

1 Donmez G，Wang D，Dena E，et al.SIRT1 Suppressesβ-amyloid production by activating the α-secretase gene ADAM10〔J〕.Cell，2010;142:320-32.

2 Bonda DJ，Lee H，Camins A，et al.The sirtuin pathway in aging and Alzheimer disease:mechanistic and therapeutic considerations〔J〕.Lancet Neurol，2011;10:275-9.

3 Elizabeth D，Brookins D.Resveratrol prevents doxorubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1 pathway〔J〕.Free Radical Biol Med，2009;46:1589-97.

4 Csiszar A，Labinskyy N，Jimenez R，et al.Anti-oxidative and anti-inflammatory vasoprotective effects of caloric restriction in aging:role of circulating actors and SIRT1〔J〕.Mech Ageing Dev，2009;130(8):518-27.

5 Lawson M，Uciechowska U.Inhibitors to understand molecular mechanisms of NAD+-dependent deacetylases(sirtuins)〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1799:726-39.

6 郭志力，戴 翔，曲東鋒.脈絡(luò)寧藥理研究和臨床研究及其在缺血性腦血管病中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2004;7(24):1849-50.

7 謝海洲.謝海洲教授治療腦髓病的經(jīng)驗〔J〕.河南中醫(yī)，2003;23(12):16-7.

8 Catarina A，F(xiàn)onseca RG，Resende R，et al.cholesterol and statins in Alzheimer's disease:current controversies〔J〕.Exper Neurol，2010;223:282-93.

Influence of Mailuoning on SIRT1 expression of brain tissue in Alzheimer's disease ratmodel

CHENG Nian，HU Jin-Zhong，TIAN Ling-Ling，et al.
Department of Biochem istry and Molecular Biology，HebeiM edical University，Shijiazhuang 050017，Hebei，China

ObjectiveTo investigate the effect of Mailuoning，traditional Chinese medicine recipe(Xie haizhou)，vitamin C+E and atorvastatin on the expression of SIRT1 gene.MethodsOvariectomized rats injected with D-galwere selected.Learning and memory abilities were evaluated by Morriswatermaze.Content of SIRT1mRNA wasmeasured by RT-PCR.Contentof SIRT1 protein wasmeasured by Western-blotting.ResultsEscape latency was longer in the OVX+D-gal group compared with that of sham group，and shorter in treatment groups compared with thatof the OVX+D-gal group.Compared with those of sham，the expressions of SIRT1 mRNA and protein were lower in those of OVX+D-gal group.Compared with OVX+D-gal group，the expressions of SIRT1 mRNA and protein in treatments group were higher.ConclusionsMailuoning，traditional Chinesemedicine recipe(Xie haizhou)，vitamins(C+E)and atorvastatin can increase the expression of SIRT1 mRNA and protein levels respectively in different degrees，which suggests that increased expression of SIRT1 could be one of themolecularmechanisms of neuroprotection of these drugs on AD ratmodel.

Alzheimer's disease;Ovariectomized;D-gal;SIRT1;Mailuoning

R339.3+8;R34;R363.2+1

A

1005-9202(2012)16-3462-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.053

2005年度河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃支持項目(05276454)

李芳芳(1958-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦衰老的分子基礎(chǔ)和中藥防治研究。

程 念(1984-)，女，碩士，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗工作。

〔2011-06-22收稿 2011-09-12修回〕

(編輯 曹夢園)