錢 明 段蒙娜 曲 進(jìn) 劉 敏 (吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

卡貝縮宮素和D型改良縮宮素在促人MG－63細(xì)胞增殖方面與天然縮宮素活性的比較

錢 明 段蒙娜 曲 進(jìn) 劉 敏 (吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 比較卡貝縮宮素和D型改良縮宮素兩種縮宮素替代物在促人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63增殖方面的效果與天然縮宮素是否存在差異。方法 用含兩種縮宮素替代物10、50、100、200 nmol/L的培養(yǎng)基孵育MG－63細(xì)胞5 d，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的變化，設(shè)空白對(duì)照組。同時(shí)以最低有效濃度50 nmol/L縮宮素作為標(biāo)準(zhǔn)組，比較兩種縮宮素替代物在促M(fèi)G－63增殖方面是否具有與縮宮素相同的生物活性。結(jié)果 D型改良縮宮素各濃度組與空白對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05);100 nmol/L和200 nmol/L卡貝縮宮素組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05);100 nmol/L卡貝縮宮素組與50 nmol/L縮宮素組比較無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論 卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面具有與縮宮素相同的生物活性;D型改良縮宮素的生物活性卻大大減弱。

縮宮素;卡貝縮宮素;D型改良縮宮素

縮宮素(oxytocin)是一種G蛋白耦聯(lián)受體激動(dòng)劑，在成骨細(xì)胞和其前體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)細(xì)胞表面都存在縮宮素相關(guān)的G蛋白耦聯(lián)受體。目前，國(guó)內(nèi)外研究已表明了其在全身應(yīng)用治療骨質(zhì)疏松和局部應(yīng)用促進(jìn)骨缺損愈合方面的廣闊前景〔1，2〕。局部應(yīng)用藥物促進(jìn)骨缺損愈合需要克服的問題是如何使藥物長(zhǎng)效作用，而常用的解決方法包括使用緩釋載體和延長(zhǎng)藥物半衰期。縮宮素在體內(nèi)通過肝、腎代謝，被血液中的細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識(shí)別和降解，半衰期僅有4 min左右。卡貝縮宮素是一種人工合成的縮宮素類似物，在血液中有較長(zhǎng)的半衰期，目前僅在產(chǎn)科領(lǐng)域應(yīng)用，有與縮宮素相近的作用，促進(jìn)平滑肌收縮。D型改良縮宮素是用D型氨基酸合成的、與天然縮宮素呈手性對(duì)稱的對(duì)映體，同樣具有逃避細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識(shí)別、延長(zhǎng)半衰期的作用。本研究以人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63為模型，比較兩種縮宮素的替代物在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖方面是否與天然縮宮素具有同樣的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MG－63購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所;OT購(gòu)自上海肽仕生物科技有限公司;Carbetocin購(gòu)自上海吉爾生化有限公司;MTT購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清、低糖DMEM及二甲基亞砜購(gòu)自杭州四季青公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式高速離心機(jī)(Hermlez323K，美國(guó))，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，超凈工作臺(tái)(上海醫(yī)療器械廠)，酶標(biāo)儀(Bio－Rad，美國(guó))，ZORBAX Poroshell 300? 液相色譜柱(Agilent，美國(guó))，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANOY，美國(guó))，電子天平(上海生物儀器廠)，無菌手術(shù)器械、細(xì)胞培養(yǎng)管及細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.2 方法

1.2.1 D型改良縮宮素合成 以Rink MBHA Amide Resin樹脂為載體，采用Fmoc固相合成方法進(jìn)行多肽合成。然后用三氟乙酸從樹脂上剪切，真空冷凍干燥。利用高效液相色譜反相柱技術(shù)分離、純化及制備。利用 Zorbax 300 SB－C8柱子，含0.1%三氟乙酸的水溶液和含0.1%三氟乙酸的乙腈做線性梯度分離，流速為2 ml/min，得到高純度D型改良縮宮素，備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 用含15%小牛血清的F12培養(yǎng)基、5%CO2全濕度、37℃條件下孵育MG－63細(xì)胞，12 h細(xì)胞貼壁，每間隔2 d換液，3 d后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈長(zhǎng)梭型，折光性良好、邊界清晰。7 d后細(xì)胞融合達(dá)80%，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，0.25%胰酶消化，1∶2傳代。至傳3代后生長(zhǎng)穩(wěn)定，備用。

1.2.3 MTT檢測(cè)兩種縮宮素替代藥物對(duì)MG－63細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MG－63細(xì)胞用0.25%胰酶消化，15%小牛血清的F12培養(yǎng)基終止消化。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板將細(xì)胞懸液調(diào)整至2.5×104/m l。取96孔板加樣200μl，5%CO2全濕度、37℃條件下孵育24 h至細(xì)胞貼壁?？ㄘ惪s宮素和D型改良縮宮素分別設(shè)10、50、100、200 nmol/L四個(gè)梯度;另設(shè)空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育時(shí)間5 d。每孔加噻唑藍(lán)20μl，4 h后取出原液，加入DMSO 150μl，搖床振蕩15min，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度。

1.2.4 兩種替代藥物與縮宮素作用效果的比較 將50 nmol/L作為縮宮素的最低有效濃度，作用于MG－63細(xì)胞系5 d，MTT法檢測(cè)其A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

卡貝縮宮素組隨著藥物濃度的增加，A值逐漸升高，表現(xiàn)出劑量依賴性，當(dāng)濃度超過100 nmol/L時(shí)與空白對(duì)照組(0.687±0.015)有顯著性差異。D型改良縮宮素組A值隨藥物濃度變化不明顯，各濃度梯度與空白對(duì)照組未見顯著性差異。50 nmol/L濃度縮宮素組A值為0.816±0.025，與對(duì)照組比較有顯著性差異。不同濃度卡貝縮宮素及D型改良縮宮素組A值比較，卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面與縮宮素具有相近的效果，而D型改良縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面沒有明顯效果。見表1。

表1 不同濃度卡貝縮宮素以及D型改良縮宮素作用于MG-63細(xì)胞5 d時(shí)A值的變化(±s)

表1 不同濃度卡貝縮宮素以及D型改良縮宮素作用于MG-63細(xì)胞5 d時(shí)A值的變化(±s)

與10 nmol/L比較:1)P＜0.05

10 nmol/L 50 nmol/L 100 nmol/L 200 nmol/L卡貝縮宮素組 0.695±0.017 0.760±0.021 0.820±0.0191) 0.871±0.0161)組別0.013 D型改良縮宮素組 0.702±0.019 0.704±0.010 0.710±0.015 0.721±

3 討論

卡貝縮宮素和D型改良縮宮素是為了克服縮宮素體內(nèi)半衰期短、容易被細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識(shí)別和降解的副作用而使用的替代性藥物。兩種藥物通過不同的機(jī)制能夠有效延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期〔3〕，但通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面仍具有與縮宮素相同的生物活性，但D型改良縮宮素的生物活性卻大大減弱。

D型改良縮宮素是通過人工合成得到的與縮宮素呈鏡像對(duì)稱的手性對(duì)映體。受體與配體的識(shí)別具有高度空間特異性，即配體表面a、b、c三個(gè)基團(tuán)與配體表面X、Y、Z活性作用點(diǎn)結(jié)合才表現(xiàn)出較高的活性〔4〕。D型改良縮宮素雖然通過改變空間結(jié)構(gòu)逃避體內(nèi)特異性酶的識(shí)別延長(zhǎng)了半衰期，但可能正是因?yàn)榭臻g構(gòu)象發(fā)生了改變，使三個(gè)特異性位點(diǎn)中只有兩個(gè)能夠結(jié)合，降低了與細(xì)胞表面功能性受體的結(jié)合能力。這就可以解釋D型改良縮宮素?zé)o法有效促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖的原因。

卡貝縮宮素與縮宮素相似，同樣由9個(gè)氨基酸組成?？s宮素肽鏈中位于1、6位的半胱氨酸之間形成二硫鍵，二硫鍵是蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中心，也是體內(nèi)細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識(shí)別和降解的位點(diǎn)。而卡貝縮宮素則是由－CH2－CH2－SCH2－結(jié)構(gòu)替代了縮宮素1、6位半胱氨酸間的二硫鍵，所以在體內(nèi)的半衰期能夠延長(zhǎng)10倍以上。但卡貝縮宮素中各活性基團(tuán)的空間位置與縮宮素基本一致，所以對(duì)MG－63細(xì)胞表面的功能性受體仍具有高度的特異性，表現(xiàn)出與縮宮素一樣的高活性〔5〕。

綜上所述，卡貝縮宮素是一種在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖方面與縮宮素具有相似作用的人工合成藥物，且具有體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)的特點(diǎn)，在局部應(yīng)用縮宮素調(diào)節(jié)骨代謝、促進(jìn)骨缺損愈合的過程中可以作為縮宮素的替代藥物使用。

1 Tamma R，Colaianni G，Zhu LL，et al.Oxytocin is an anabolic bone hormone〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2009;106(17):7149－54.

2 Elabd C，Basillais A，Beaupied H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

3 Sclafani A，Rinaman L，Vollmer RR，et al.Oxytocin knockoutmice demonstrate enhanced intake of sweet and nonsweet carbohydrate solutions〔J〕.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2007;292(8):1828－33.

4 Elabd SK，Sabry I，Hassan WB，etal.Possible neuroendocrine role for oxytocin in bone remodeling〔J〕.Endocr Regul，2007;41(4):131－41.

5 Elabd C，Basillais A，Beaupled H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

R71

A

1005-9202(2012)16-3473-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.058

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(No.200705195);吉林大學(xué)博士研究生交叉學(xué)科科研資助項(xiàng)目(No.450091102521)

劉 敏(1973－)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事硬組織代謝及骨替代材料研究。

錢 明(1981－)，男，醫(yī)師，在讀博士，主要從事硬組織代謝及骨替代材料研究。

〔2012－01－09 收稿 2012－01－19 修回〕

(編輯 袁左鳴)