劉曉燕 付秀美 高 宇 陳志宏 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 承德 067000)

絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

劉曉燕 付秀美1高 宇 陳志宏1(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 承德 067000)

目的觀察絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法雄性SD大鼠36隨機(jī)分為3組:正常對照組、糖尿病模型組和絲膠治療組。鏈脲佐菌素(STZ，25 mg/kg，連續(xù)3 d)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型;待模型成功建立后，絲膠治療組大鼠給予絲膠灌胃(2.4 g·kg－1·d－1)35 d。免疫組織化學(xué)染色觀察胰島β細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01);與模型大鼠相比，絲膠治療組大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論絲膠可通過上調(diào)胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)、下調(diào)胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，抑制2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡，對糖尿病時(shí)胰島細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

絲膠;2型糖尿病;胰島β細(xì)胞;Bcl-2;Bax

針對糖尿病復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，有學(xué)者提出胰島β細(xì)胞增殖、凋亡失衡在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用〔1，2〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔3，4〕，體內(nèi)某些抗凋亡基因表達(dá)增強(qiáng)，可促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，進(jìn)而對抗血糖的升高。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)致2型糖尿病大鼠模型為研究對象，探討了蠶繭提取物——絲膠對胰島β細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的變化，以期為臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 STZ購于美國Sigma公司，臨用時(shí)用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%溶液。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司，批號(hào):20071030。兔抗Bax及Bcl-2多克隆抗體，美國Santa Cruz公司，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組 清潔級雄性SD大鼠36只，分為正常對照組、糖尿病模型組和絲膠治療組(n=12)。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對照組，不做任何處理。其余24只大鼠采用小劑量STZ連續(xù)(25 mg/kg，3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病模型，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn);待模型成功建立后，隨機(jī)分為模型組和絲膠治療組(n=12)，模型組大鼠不再做任何處理，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃 35 d。

1.3 檢測血糖 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，離心后收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4 胰島β細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的檢測 大鼠取血后斷頭處死，取胰腺入Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學(xué)染色觀察胰島β細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。一抗均為兔抗，稀釋濃度Bcl-2為1∶50、Bax為1∶100，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。定量分析:采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×40倍顯微鏡下對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取胰島作為觀察視野，計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占胰島面積的比值。每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個(gè)胰島，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血糖 糖尿病模型大鼠的血糖明顯高于正常大鼠(P＜0.01)，絲膠治療組大鼠的血糖明顯低于模型大鼠(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血糖及胰島β細(xì)胞Bcl-2 Bax蛋白表達(dá)的比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠血糖及胰島β細(xì)胞Bcl-2 Bax蛋白表達(dá)的比較(±s，n=12)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別 血糖(mmol/L)Bcl-2 Bax正常對照組 10.83±2.031) 0.017 4±0.000 81)0.301 5±0.017 41)模型組 29.45±4.82 0.007 6±0.000 6 0.539 8±0.041 1絲膠治療組 13.20±4.091) 0.017 1±0.000 21)0.308 0±0.013 41)

2.2 各組大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá) Bcl-2蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)，免疫陽性細(xì)胞主要為胰島β細(xì)胞(圖1)。Bcl-2蛋白定量分析結(jié)果見表1，糖尿病模型大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯低于正常大鼠(P＜0.01);絲膠可明顯提高糖尿病模型大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，絲膠治療組大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá) Bax蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)，免疫陽性細(xì)胞主要為胰島β細(xì)胞(圖2)。Bax蛋白定量分析結(jié)果見表1，糖尿病模型大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)明顯高于正常大鼠(P＜0.01);絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，絲膠治療組大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)明顯低于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)(×400)

圖2 各組大鼠胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)(×400)

3 討論

Bcl-2是目前公認(rèn)的抗凋亡基因，可通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡〔5，6〕;Bax是Bcl-2家族成員之一，可互相結(jié)合形成同源二聚體，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔7，8〕。Bcl-2蛋白可以與Bax蛋白競爭結(jié)合，形成比Bax-Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bcl-2-Bax異源二聚體，從而使Bax-Bax同源二聚體分開，減弱Bax蛋白的誘導(dǎo)凋亡作用。因此，細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2和細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子Bax比率不同將決定細(xì)胞受到凋亡刺激信號(hào)后是生存還是凋亡，Bcl-2占優(yōu)勢則細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢則細(xì)胞凋亡〔9〕。目前認(rèn)為，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，Bcl-2表達(dá)降低和(或)Bax表達(dá)升高是促使胰島β細(xì)胞凋亡的重要原因之一。Federici等〔10〕的研究表明，高糖可導(dǎo)致Bax過度表達(dá)，使胰島β細(xì)胞凋亡增加，提示高糖可通過改變Bcl-2家族之間的平衡影響β細(xì)胞的凋亡。

糖尿病屬中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“消渴癥”范疇，治療原則為生精清熱、潤燥養(yǎng)陰等。蠶繭，蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，具有滋陰潤燥、生精止渴作用，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消〔11，12〕。絲膠為天然高分子水溶性蛋白，約占繭絲的30%，在繅絲和精練時(shí)極大部分作為廢料遭到遺棄，學(xué)者們一直在探討對絲膠的有效利用。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯上調(diào)糖尿病模型大鼠胰島β細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)、下調(diào)胰島β細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)。一方面，增多的Bcl-2蛋白可通過阻斷凋亡信號(hào)傳遞和凋亡基因產(chǎn)物的表達(dá)、提高抗氧化能力抑制胰島β細(xì)胞的凋亡;另一方面，增多的Bcl-2蛋白可與Bax蛋白競爭結(jié)合形成Bcl-2-Bax異源二聚體，減弱Bax蛋白誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的作用。因此，本研究表明絲膠可明顯抑制糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞的凋亡，可保護(hù)糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞損傷，對糖尿病及其并發(fā)癥具有一定的治療作用。

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9 Del Principe MI，Del Poeta G，Venditti A，et al.Apoptosis and immaturity in acutemyeloid leukemia〔J〕.Hematology，2005;10(1):25-34.

10 FedericiM，Hribal M，Perego L，et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of Langerhans:a potential role for regulation of specific Bcl family genes toward an apoptotic cell death program〔J〕.Diabetes，2001;50(6):1290-301.

11 李時(shí)珍.本草綱目〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1985:1045-52.

12 鮑相敖.驗(yàn)方新編〔M〕.天津:天津科技出版社，1993:736-40.

Protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type 2 diabetes rats

LIU Xiao-Yan，F(xiàn)U Xiu-M ei，GAO Yu，et al.
Department of Endocrinology，the A ffiliated Hospital of Chengde M edical College，Chengde 067000，Hebei，China

ObjectiveTo observe the protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type2 diabetes rats.Methods36male SD rats were random ly divided into 3 groups and each group had 12 rats:normal control，diabetesmodel and sericin treatment groups.Diabetesmodel weremade by injecting 2%STZ(25mg/kg，3 d)into the abdominal cavity continuously.After the diabetesmodelwas successfully established，the rats in model group had no more treatment;the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin(2.4 g·kg－1·d－1)for 35 days.SP immunohistochemical staining was used to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein in β cells of islet.ResultsCompared with normal control rats，the Bcl-2 expression inβ cells of islet of rats inmodel group was decreased obviously，Bax expression increased obviously(P＜0.01).Compared with model rats，the Bcl-2 expression inβcells of islet of rats in sericin treatmentwas increased obviously，Bax expression decreased obviously(P＜0.01).ConclusionsSericin can inhibitβ cell apoptosis by up-regulating Bcl-2 expression and downregulating Bax expression and have protective effects onβcells injury during diabetes.

Sericin;Type 2 diabetes;βcell of islet;Bcl-2;Bax

R587

A

1005-9202(2012)12-2525-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.039

河北省科技廳項(xiàng)目(No.08276101D-19);河北省教育廳項(xiàng)目(No.2006301)

1 承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)研究。

劉曉燕(1965-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事糖尿病神經(jīng)病變臨床研究。

〔2011-09-16收稿 2011-12-20修回〕

(編輯 曹夢園)