崔 智，李曉娟，白云峰，侯 俊，戴廣海，李瑞生

(1.解放軍總醫(yī)院腫瘤綜合治療科，北京 100853；2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)保障中心，北京 100039)

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的模型動(dòng)物被廣泛地應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)研究中。2001年 Song C等［1］在哺乳動(dòng)物中克隆出與 PLC210同源序列的PLC，由于與其他已知的PLC不同，因而被命名為PLCε，2003年采用基因打靶法成功建立了 PLCε基因敲除小鼠。該模型小鼠其繁殖后代中有敲基因型、雜合型和野生型等三種混合類型，但從外觀表型上很難鑒別其各自不同的基因類型。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)是采用多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)來(lái)對(duì)遺傳物質(zhì)DNA直接進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以分析其遺傳特性，該技術(shù)在大小鼠遺傳監(jiān)測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用，并驗(yàn)證了它的準(zhǔn)確性和可靠性［2］。因此，本研究應(yīng)用所篩選的13個(gè)具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)和2個(gè)通過(guò)敲除基因序列自行設(shè)計(jì)的引物，對(duì)PLCε基因敲除小鼠群體的遺傳背景進(jìn)行有效地遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)，旨在分析其遺傳背景特性和鑒別所生產(chǎn)繁殖的三種(敲基因型、雜合型和野生型)不同基因類型小鼠，為今后進(jìn)行模型動(dòng)物的研究和開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

PLCε基因敲除小鼠來(lái)源于日本神戶大學(xué)，由解放軍第302醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心生產(chǎn)繁殖，隨機(jī)選取6～8周齡小鼠28只，雌雄各半，編號(hào)1～14號(hào)為雌性，15～28號(hào)為雄性，單鼠體質(zhì)量為20g～25g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)-2007-010。剪小鼠尾巴，-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 藥品與生化試劑

硝酸銀、冰醋酸、三羥甲基胺基甲烷、過(guò)硫酸銨、無(wú)水碳酸鈉、甲醛、無(wú)水乙醇，DNA提取緩沖液，Taq DNA聚合酶和10×buffer(寶生物公司)，dNTP (Sangon公司)，TEMED(Sigma公司)。

1.3 引物合成

選擇具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星 DNA位點(diǎn)：D1Mit365、D3Mit51、D4Mit235、D6Mit102、D7Mit281、D8Mit113、 D9Mit23、 D10Mit180、 D13Mit88、D16Mit145、D17Mit36、D18Mit94、D19Mit97、Dq(敲基因型)和Dy(野生型)等15個(gè)微衛(wèi)星基因座位點(diǎn)，這些位點(diǎn)引物序列均來(lái)自參考文獻(xiàn)［3，4］，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提?。簩?8只小鼠尾巴各剪取1cm左右，剪細(xì)碎后放于2.0m L EP管內(nèi)，加入30μL～35μL蛋白K及470μL DNA提取緩沖液，將其上下顛倒充分混勻后，置于 37℃水浴鍋內(nèi)過(guò)夜，待其全部消化溶解后，用等體積的Tris飽和酚和三氯甲烷分3次進(jìn)行抽提DNA，用冰無(wú)水乙醇析出基因組DNA，干燥后用(50～200)μL TE全部溶解，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)其樣品的純度和濃度，配制成100ng/uL左右，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR的擴(kuò)增：每個(gè)PCR擴(kuò)增體系為50μL，緩沖液 buffer 5μL，上下游引物各 0.2μmol/L，dNTP 200μmol/L，Taq酶1U，DNA模板為1μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，48℃ ～65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)25～30次，最后一個(gè)循環(huán)延伸 7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于 4℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.3 電泳與銀染檢測(cè)；抽取已加入染料的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，注入8%聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，200V電泳1h～2h。電泳后的凝膠用10%冰醋酸固定，硝酸銀染色，碳酸鈉顯色，待條帶清晰后，用終止液停顯。然后進(jìn)行圖帶拍照保存分析。

1.4.4 結(jié)果判讀與分析：根據(jù)電泳后聚丙烯酰胺凝膠上的DNA圖帶，其泳動(dòng)距離遠(yuǎn)近進(jìn)行判讀，按泳動(dòng)距離遠(yuǎn)近設(shè)定為阿拉伯字母1、2、3……N，如果DNA圖帶泳動(dòng)距離一致，可判定為單態(tài)性，若有差異可判定為多態(tài)性［5］。對(duì)于 Dq和 Dy兩個(gè)位點(diǎn)的電泳圖帶，如果只有Dy位點(diǎn)有圖帶，而Dq位點(diǎn)沒(méi)有圖帶，可判定為野生型；如果Dq和Dy兩位點(diǎn)都有擴(kuò)增圖帶，可判定為雜合型；若只有Dq位點(diǎn)有圖帶，而Dy位點(diǎn)沒(méi)有擴(kuò)增圖帶，則可判定為敲基因型。

2 結(jié)果

2.1 15個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)PCR擴(kuò)增條件分析

利用1號(hào)小鼠DNA對(duì)所篩選的15個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的各種濃度梯度條件進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)凝膠電泳圖帶的清晰程度、泳動(dòng)距離進(jìn)行了對(duì)比分析，獲得各個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)最佳Mg2+濃度、退火溫度、擴(kuò)增片段大小和擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)等擴(kuò)增條件(表1)。

表1 15個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)最佳PCR擴(kuò)增條件Tab.1 The best conditions of PCR amplification of 15microsatellite DNA loci

圖1 D3Mit51位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA圖譜注：M：為marker，1-14：為1號(hào)-14號(hào)小鼠個(gè)體Fig.1 DNA mapping of amp lification of D3M it51locusNote：M：Marker；1-14：For 1-14individuals of mice

2.2 13個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果的分析

利用所獲得的13個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的最佳PCR擴(kuò)增條件對(duì)28只小鼠分別進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果每個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的28只小鼠所擴(kuò)增出來(lái)的圖帶其泳動(dòng)距離一致，均呈單態(tài)性，其中D3Mit51位點(diǎn)單態(tài)性的擴(kuò)增圖譜結(jié)果(圖1)。說(shuō)明了此小鼠遺傳背景呈現(xiàn)一致性，沒(méi)有發(fā)生遺傳變異，保持了遺傳的穩(wěn)定性。

2.3 Dq和Dy兩個(gè)位點(diǎn)三種基因型的鑒別分析

利用Dq和Dy兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)28只小鼠進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其電泳圖帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)4，6，11，16，19和23號(hào)小鼠的Dq位點(diǎn)有圖帶，而Dy位點(diǎn)沒(méi)有圖帶，則可判定為敲基因型；5，9，14，17，21，22和28號(hào)小鼠的Dy位點(diǎn)有圖帶，而Dq位點(diǎn)沒(méi)有圖帶，則可判定為野生型；而1，2，3，7，8，10，12，13，15，18，20，24，25，26和27號(hào)小鼠的Dq和 Dy兩位點(diǎn)都有擴(kuò)增圖帶，則可判定為雜合型。其中1-8號(hào)小鼠Dy和Dq兩位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增圖帶(圖2和圖3)。

圖2 Dy位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA圖譜注：M：為Marker，1-8：為1-8號(hào)小鼠個(gè)體Fig.2 DNA mapping of amplification of Dy locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

3 討論

小鼠微衛(wèi)星基因座位點(diǎn)存在于整個(gè)基因組中，其核心序列為2～6bp的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)達(dá)幾次甚至幾十次，由于其重復(fù)次數(shù)的不同而呈現(xiàn)出微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的高度多態(tài)性。正是利用此特點(diǎn)可以對(duì)近交系、封閉群、雜合群及不同品系動(dòng)物的遺傳背景進(jìn)行有效地監(jiān)測(cè)分析，目前在小鼠基因圖譜中包含了7 377個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)，其中有6580個(gè)顯示多態(tài)性［6］。本實(shí)驗(yàn)所選取的敲基因小鼠是來(lái)源于日本神戶大學(xué)實(shí)驗(yàn)室［7］，由302醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心保種繁殖，沒(méi)有引入外來(lái)血緣。人們采用基因敲除技術(shù)已建立了許多人類疾病動(dòng)物模型，如敲基因小鼠模型［8］、膀胱癌動(dòng)物模型［9］、皮膚癌動(dòng)物模型［10］、前列腺癌動(dòng)物模型［11］等，但這些敲基因動(dòng)物模型的遺傳背景是否發(fā)生了改變，以及變異的程度還不是很清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)利用所篩選的13個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)對(duì)所選取的28只成年小鼠進(jìn)行了遺傳背景的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示13位點(diǎn)均呈現(xiàn)一條圖帶且泳動(dòng)距離一致，說(shuō)明該位點(diǎn)純合且呈單態(tài)性，從而說(shuō)明了該群體的遺傳背景均一，沒(méi)有發(fā)生遺傳污染或遺傳變異，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系的基本要求。因此，應(yīng)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)可以進(jìn)行純合位點(diǎn)的判定，同時(shí)也能對(duì)位點(diǎn)的變異情況進(jìn)行分析，適于近交系動(dòng)物的遺傳質(zhì)量檢測(cè)［12］。這些高度多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)曾在不同品系大小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)中得到過(guò)有效驗(yàn)證［13，14］。

圖3 Dq位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA圖譜注：M：為Marker，1-8：為1-8號(hào)小鼠個(gè)體Fig.3 DNA mapping of amplification of D3Mit51locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

該群體小鼠是嚴(yán)格按照雜合型自交方式來(lái)進(jìn)行繁殖，按照孟德爾遺傳學(xué)繁殖規(guī)律所產(chǎn)生的繁殖后代均會(huì)出現(xiàn)三種不同的基因型［15］，但從外觀上很難鑒別。因此，本實(shí)驗(yàn)利用2個(gè)特殊位點(diǎn)對(duì)所選取的28只成年小鼠進(jìn)行了遺傳背景分析，鑒別出敲基因型小鼠6只，野生型小鼠7只和雜合型小鼠15只，該方法可以有效地鑒別出三種不同基因型小鼠，為今后該小鼠的應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的保障［16］。

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