蘇愛華，叢 喆，王 衛(wèi)，陳 霆，魏 強

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

B淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅可以通過合成與分泌抗體介導體液免疫應答，還能分泌細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)［1］。B淋巴細胞在抗SIV/HIV感染中也有一定的免疫保護作用，但因機體內(nèi)影響因素眾多，導致在研究其具體功能時受到了一定的干擾，所以應用B細胞敲除的方法反向研究B淋巴細胞在SIV/HIV感染中的作用，具有非常重要的意義。鑒于目前缺乏去除恒河猴體內(nèi)B淋巴細胞的試劑，本研究擬通過一次性靜脈滴注抗人B淋巴細胞單克隆抗體去除恒河猴 B淋巴細胞，評估并測定中國恒河猴外周血、外周淋巴結(jié)及十二指腸腸黏膜組織中B淋巴細胞敲除效果及轉(zhuǎn)歸情況，為深入探討B(tài)淋巴細胞SIV/HIV感染中的作用，與病毒的復制以及疾病進程的關(guān)系，提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康中國恒河猴2只，購自北京協(xié)爾鑫公司［SCXK(京)2005-2005］，體重3.2kg～3.5kg。間接免疫熒光法(IFA)檢測排除相關(guān)慢病毒——猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1)、猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。

1.2 試劑

1.2.1 利妥昔單抗注射液(rituximab，50mg/kg)：商品名美羅華(MabThera，Cat No.B6094)，是Roche公司生產(chǎn)的抗人B淋巴細胞單克隆抗體。

1.2.2 流式抗體：Percp anti-human CD3(BD，Cat No.552851)，F(xiàn)ITC anti-human CD4(Biolegend，Cat No.317408)，PE anti-human CD8(Biolegend，Cat No.301008)，APC anti-human CD20(Biolegend，Cat No.302310)。

1.3 給藥方式

中國恒河猴2只，G1205和 G1206，按50mg/kg劑量下肢靜脈滴注利妥昔單抗注射液。靜脈滴注過程中注意速度(約60滴/min，全部過程(1～2) h完成)，同時注意預防過敏等不良反應的發(fā)生。

1.4 組織細胞取材和預處理

1.4.1 外周血的采集：靜脈滴注前及靜脈滴注后1、4、7、10、14、18、21、25、28、42、56d采集實驗猴EDTA抗凝血進行流式檢測。

1.4.2 外周淋巴結(jié)采集及細胞分離：靜注前及靜注后7、14、21、28、42、56d采集腹股溝淋巴結(jié)。在生物安全柜中將淋巴結(jié)的包膜以及脂肪組織剔除，沖洗干凈、剪碎，置于70μm的尼龍細胞篩上輕輕研磨，用含5%胎牛血清及5%雙抗(10000單位/mL青霉素和10000μg/m L鏈霉素)的RPM I 1640培養(yǎng)基沖洗。離心并收集細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度至1×106個/m L。

1.4.3 腸道組織采集及細胞分離：動物在行內(nèi)窺鏡前禁食8h～12h，給予復方氯胺酮注射液(生理鹽水1：5稀釋后0.1m L/kg)肌內(nèi)注射麻醉，然后使用Olympus內(nèi)窺鏡(型號GIF-160)及配套設(shè)備，在十二指腸降段取4～6塊活檢組織［2］。將新鮮腸道組織置于70μm的尼龍細胞篩上輕輕研磨，并用含5%胎牛血清以及5%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗。離心并收集細胞沉淀，調(diào)整濃度至1×106個/m L。

1.5 流式抗體檢測

將EDTA抗凝血和新鮮制備的淋巴細胞進行流式抗體檢測。分別取50μL的EDTA抗凝血或淋巴細胞懸液(106個/50μL)，依次加入流式抗體—CD3(percp)、CD8(PE)、CD4(FITC)和CD20(APC)。室溫避光作用15min后(全血檢測管需另加入終濃度10%的紅細胞裂解液，4℃作用10min)，重懸于pH 7.2PBS中，F(xiàn)ACS儀上分類計數(shù)［3］。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用Flowjo version 7.6進行流式數(shù)據(jù)分析，作圖及統(tǒng)計分析由Graphpad Prism 5完成。

2 結(jié)果

2.1 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后外周血中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化

靜脈滴注利妥昔單抗注射液作用24h后，恒河猴G1205和G1206外周血中B淋巴細胞的百分比即從正常的50%左右降低到0%，絕對數(shù)也從第0天的240cells/μL降到了0，去除率達到100%，去除時間維持約14d。28d時 B淋巴細胞的百分比

恢復到4～8%左右，絕對數(shù)也逐漸恢復到10～30cells/μL。到56d時，已接近實驗前的水平(圖1A，B)。在 B淋巴細胞成功去除的同時，CD4+T及CD8+T淋巴細胞波動平穩(wěn)，CD4+T淋巴細胞的波動范圍在60～70%之間，CD8+T淋巴細胞的波動范圍在20～40%之間(圖1C，D)。

2.2 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化

實驗前，G1205和G1206兩只恒河猴腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細胞比例為20%～30%，利妥昔單抗注射液靜脈滴注后7 d，B淋巴細胞比例為0%，去除率達到100%，到第21天之前，B淋巴細胞升高幅度很小，恢復到3%左右。到第28天時，B淋巴細胞比例較前明顯上升，56d時，G1206號猴B淋巴細胞恢復接近正常值，G1205號猴恢復到15%左右(圖2A)。

圖1 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后外周血中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化注：A：CD20+細胞的百分比；B：CD20+細胞的絕對數(shù)；C：CD4+T細胞的百分比；D：CD8+T細胞的百分比Fig.1 Changes of the concentrations of B-and T-cell subsets in peripheral blood afterintravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The absolute numbers of CD20+cells；C：The percentage of CD4+T-cells；D：The percentage of CD8+T-cells

圖2 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化注：A：CD20+細胞的百分比；B：CD4+T細胞的百分比；C：CD8+T細胞的百分比；LN：淋巴結(jié)Fig.2 Percentage of B-and T-cell subsets in the inguinal lymph nodes after intravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T-cells；C：The percentage of CD8+T-cells.LN：inguinal lymph nodes

在靜注利妥昔單抗注射液之前G1205和G1206兩只恒河猴的腹股溝淋巴結(jié)中的CD4+T淋巴細胞

約75%左右，靜脈滴注后第14天時稍有下降，約降低到60%左右，隨后的兩個月內(nèi)都較平穩(wěn)，并一直維持在60%～70%之間；其CD8+T淋巴細胞在靜脈滴注利妥昔單抗注射液之后的第14天時由第0天的15～20%上升到了30%左右，之后的兩個月內(nèi)CD8+T淋巴細胞的水平維持在 25% ～35%之間(圖2B，C)。

2.3 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后十二指腸黏膜固有層中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化

兩只實驗猴在實驗前十二指腸黏膜固有層中B淋巴細胞比例約為5%～10%。靜脈滴注利妥昔單抗注射液后7 d，降低到1.0% ～1.5%，去除率約80% ～90%。恒河猴 G1205一直維持這種狀態(tài)至觀察結(jié)束的56d，G1206維持到28d，隨后升高，42d時達到30%，56d時下降到20%(圖3A)。

十二指腸黏膜固有層中的CD4+T細胞只在第14天時由第7天的15%上升到29% ～36%之間，其余時間點的CD4+T細胞的水平未見明顯波動，均維持在10%～20%之間，其CD8+T細胞的水平與CD4+T細胞相反，在第14天時，兩只恒河猴的CD8+T細胞均有所下降，到第21天時，其 CD8+T細胞上升到60%～70%之間(圖3B，C)。

圖3 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后十二指腸黏膜固有層中B淋巴細胞及T淋巴細胞亞群的變化注：A：CD20+細胞的百分比；B：CD4+T細胞的百分比；C：CD8+T細胞的百分比；LP：指腸黏膜固有層Fig.3 Changes of the percentages of B-and T-cell subsets in the duodenal biopsy specimens after intravenous injection of rituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T cells；C：The percentage of CD8+T cells；LP：Duodenal biopsy specimens

3 討論

B淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅可以通過合成與分泌抗體介導體液免疫應答，還能通過分泌細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)［1］。以往研究表明，與正常HIV-1感染者相比，B淋巴細胞缺失患者的病毒載量要高2個數(shù)量級 (1.7 log10)［5］。Miller等人也在實驗中發(fā)現(xiàn)，敲除了B淋巴細胞的恒河猴與正常感染SIV的恒河猴相比較，不僅能使病毒載量升高，而且發(fā)展成為 AIDS的時間也會縮短［6］。這些都充分說明，B淋巴細胞在控制SIV/HIV病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。但因機體內(nèi)影響因素眾多，導致在研究其具體功能時受到了一定的干擾。國外近幾年已經(jīng)開始利用利妥昔單抗開展AIDS的研究工作，目的在于利用B淋巴細胞缺失的動物模型，反向研究在B淋巴細胞缺失的情況下，SIV/HIV感染時機體免疫水平和病毒水平的變化，從而間接地了解B淋巴細胞的功能。目前這項工作在國內(nèi)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域還是空白。

本研究使用抗人B淋巴細胞單克隆抗體(利妥昔單抗注射液)，通過靜脈滴注的方式，觀察一次性給藥后中國恒河猴外周血及淋巴組織B淋巴細胞敲除情況。在長達兩個月的觀察期內(nèi)，系統(tǒng)測定了外周血、外周淋巴結(jié)及腸黏膜固有層中B淋巴細胞的比例變化情況。結(jié)果表明，利妥昔單抗能夠降低甚至完全去除恒河猴血液、腹股溝淋巴結(jié)中的B淋巴細胞，其外周血和淋巴結(jié)中的B淋巴細胞的去除率達到100%。十二指腸腸粘膜固有層中B細胞的去除率也能達到80%以上，且能持續(xù)28d甚至更長時間，這個結(jié)果顯示B細胞在十二指腸黏膜中的清除時間比外周血和淋巴結(jié)中的清除時間都更持久。這一結(jié)果與 Gaufin等人的研究基本相同［7］。不同的是，近幾年國外在開展此項研究時，基本上是采取連續(xù)給藥的方式。Gaufin在對非洲綠猴進行B淋巴細胞敲除時，就采取每21d靜注 Rituximab一次的方案，直到SIVagm感染后的第184天［7］。本研究沒有使用上述方法，只是進行了單次滴注，主要是為了了解中國恒河猴在靜脈滴注妥昔單抗注射液后各個組織中B淋巴細胞的去除效果及轉(zhuǎn)歸規(guī)律，得到第一手的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為今后深入開展B淋巴細胞功能研究提供依據(jù)，以便根據(jù)具體的研究目的制訂相應的實驗方案。

在靜脈注射利妥昔單抗注射液之前，我們分別檢測了血液，腹股溝淋巴結(jié)以及十二指腸黏膜組織中的B細胞和T細胞亞群的變化，各組織中CD20+B淋巴細胞的百分比均與之前文獻報道的一致［7］。血液和淋巴結(jié)中，CD4+T淋巴細胞在60%～80%之間，CD8+T淋巴細胞在20～40%之間；而在十二指腸黏膜固有層中 CD4+T淋巴細胞的比例卻只有15% ～40%，CD8+T淋巴細胞比例的波動范圍較大，在35% ～70%之間。腸黏膜固有層中 CD4+T淋巴細胞的比例與血液和淋巴結(jié)相比較含量最低，這一結(jié)果與本實驗室長期研究的結(jié)果相符合［3］。但總的來說，在成功去除B淋巴細胞的情況下，T淋巴細胞變化較平穩(wěn)，保持了體內(nèi)的基本穩(wěn)定狀態(tài)，在比例上沒有過多受B淋巴細胞去除的影響。也有研究表明，在小鼠體內(nèi)敲除B淋巴細胞后，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后并未出現(xiàn)表型和功能異常的T細胞，這就保證了在B淋巴細胞去除的情況下，CD4+T及CD8+T淋巴細胞能維持相對穩(wěn)定的功能。這一結(jié)果對我們研究B淋巴細胞的功能方面是有益處的。

總之，無論是血液，淋巴結(jié)還是十二指腸黏膜固有層，抗人B淋巴細胞單克隆抗體(利妥昔單抗注射液)均能有效去除恒河猴體內(nèi)B淋巴細胞，并且在成功敲除 B淋巴細胞的情況下，CD4+T及CD8+T淋巴細胞無明顯波動，維持在一個穩(wěn)定的水平。

［1］何維.醫(yī)學免疫學(第2版)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社.2010：322-327.

［2］劉穎，朱華，叢喆，等.SHIV感染恒河猴十二指腸黏膜活檢組織病理學觀察［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19(3)：18-31.

［3］熊競，劉克劍，吳芳新，等.健康中國恒河猴各淋巴組織中T淋巴細胞表型及分布［J］.中國畜牧獸醫(yī)， 2012，39 (2)：86-91.

［4］Tasca S，Zhuang K，Gettie A，et al.Effect of B-cell depletion on coreceptor switching in R5simian-human immunodeficiency virus infection of rhesus macaques［J］.J Virol，2011，85(7)：3086-3094.

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［7］Gaufin T，Pattison M，Gautam R，et al.Effect of B-cell depletion on viral replication and clinical outcome of simian immunodeficiency virus infection in a natural host.J Virol，2009，83(20)：10347-10357.