向志光，劉先菊，佟 巍，李雨函，張麗芳，魏 強

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部實驗動物檢測中心，北京 100021)

仙臺病毒是實驗用大小鼠嚴(yán)格控制的病原體，在我國的實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中對用清潔級以上的實驗用大小鼠均需要排除該病原體的干擾［1］，并且確定以血清學(xué)檢測實驗動物自身攜帶的抗病毒抗體水平以評價實驗動物的質(zhì)量。目前對于仙臺病毒的血清學(xué)檢測的ELISA方法中多使用病毒的天然抗原，因為天然抗原更具有代表性。但是目前對于各類獲取的天然病毒抗原的均質(zhì)化處理，以及天然抗原對于酶標(biāo)板的吸附性狀的研究較少。

本文報道了我中心采用BHK-21細(xì)胞擴(kuò)增仙臺病毒，使用差速離心去除了培養(yǎng)細(xì)胞碎片，富集了仙臺病毒。對收集的仙臺病毒采用超聲波進(jìn)行均質(zhì)化處理，和未處理的病毒顆粒做比較包被酶標(biāo)板，用仙臺病毒的免疫血清在兩種平板做測試，通過比較測試數(shù)據(jù)的變異率分析了超聲波處理對于酶標(biāo)板包被抗原的均質(zhì)性和抗原穩(wěn)定性的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)控血清的來源

仙臺病毒和BHK-21細(xì)胞來自美國ATCC。SPF小鼠血清采自北京華阜康生物技術(shù)有限公司提供的6～8周齡SPF級實驗小鼠外周血。免疫質(zhì)控血清按照本中心之前報道的方法進(jìn)行制備［2］。

1.2 病毒的擴(kuò)增和濃縮純化

使用仙臺病毒接種感染BHK-21細(xì)胞，感染3d后收集培養(yǎng)物經(jīng)-80℃至室溫的反復(fù)凍融3次，后經(jīng)56℃水浴30min對仙臺病毒滅活處理。培養(yǎng)物經(jīng)4℃ 10000r/m in離心30min去除細(xì)胞碎片，收集上清經(jīng)4℃ 35000r/min離心3h收集沉淀病毒顆粒。使用生理鹽水反復(fù)吹打沉淀物至呈均勻分散相，使用12000r/min 30min低溫離心去除結(jié)塊不溶物。使用BCA法測定蛋白濃度。

1.3 病毒的超聲波處理

取濃度為3mg/m L病毒重懸物1m L，放置冰上，使用小探頭進(jìn)行超聲處理，超聲頻率為20kHz，振幅30%，功率設(shè)定在300W。超聲處理5s，停10s，連續(xù)處理60次。將超聲處理后的病毒再次進(jìn)行12000r/min 30min低溫離心，去除不溶物，再次用BCA法測定蛋白濃度。

1.4 酶標(biāo)板的包被和血清樣品的檢測

將未經(jīng)超聲處理的仙臺病毒抗原和超聲處理的抗原按照1μg/m L的濃度重懸于包被液，按照每孔100μL包被酶標(biāo)板，4℃包被過夜，室溫封閉后加入待測試樣品37℃孵育1h。使用PBST洗板3次后加入酶標(biāo)記物(1∶20000稀釋的rabbit anti-mouse IgG-HRP)37℃孵育1h。使用PBST洗板3次后加入TMB底物液，10min內(nèi)加入2M H2SO4終止顯色反應(yīng)。至A450進(jìn)行檢測。

1.5 變異系數(shù)(變異率)的計算

對標(biāo)準(zhǔn)免疫血清做梯度稀釋至從1∶40至1∶2560，每個稀釋度重復(fù)測試6個孔。2份 SPF血清也進(jìn)行6個孔的重復(fù)測試。對各樣品做均值和標(biāo)準(zhǔn)差的統(tǒng)計，測定變異系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)差/均值 ×100%做變異率統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 超聲處理對仙臺病毒抗原的抗原性無顯著影響

各血清樣品在2種平板A450的測量均值如圖1所示。SeV的免疫小鼠血清稀釋至1∶40、1∶80、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，測量數(shù)值在2種平板的測量值均逐漸下降，多次測量此種趨勢一致。2份SPF小鼠血清(NC1和NC2)的測量值在0.2以下。在超聲處理的SeV病毒抗原包被平板中各樣品的測量值均低于其在未經(jīng)超聲處理抗原平板的數(shù)據(jù)，但差異較小，超聲處理未能顯著影響仙臺病毒抗原的抗原性。

圖1 梯度稀釋SeV免疫血清(P)和SPF血清(NC)在兩種抗原平板的A450檢測均值Fig.1 The average A450of gradient diluted SeV-immunizedserum(P)and SPF sera(NC)in the two kinds of plates

2.2 超聲處理抗原包被平板同一樣品檢測孔間變異率較小

各血清樣品在2種平板A450的測量均的變異率(%)如圖2所示。各梯度小鼠免疫血清樣品在未經(jīng)超聲處理仙臺病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率在1.97%～6.02%之間；在經(jīng)超聲處理仙臺病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率在0.53%～2.26%之間；2份SPF小鼠血清在未經(jīng)超聲處理的平板的測量值變異率為 6.81%和7.46%，在超聲處理的平板的測量值變異率為2.79%和 4.34%，均高于免疫血清測量值的變異率；但所有樣品在經(jīng)超聲處理的病毒抗原包被ELISA檢測中測量值的變異率均較小。

圖2 各血清樣品在2種平板A450測量值的變異率(%)Fig.2 The coefficient of variation(CV%)of the tested samp les(A450)in the two kinds of plates

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)在實驗動物的病原學(xué)檢測中主要是利用病毒抗原包被在酶標(biāo)板孔的底面，以吸附的抗原物質(zhì)檢測待檢血清樣品中抗病毒的抗體水平，因此病毒抗原的抗原性、抗原和酶標(biāo)板底面的吸附性、抗原包被的劑量和檢測抗體的容量等都是影響ELISA檢測方法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。因此尋找病原體特異性的抗原是首要因素，在小鼠的仙臺病毒ELISA檢測試劑盒的設(shè)計上我們依然選擇病毒的天然抗原作為抗原物質(zhì)進(jìn)行包被，這樣就排除了使用重組表達(dá)抗原漏檢的可能性［3］。我們對仙臺病毒的雞胚培養(yǎng)物和BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物做了比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)物的仙臺病毒經(jīng)后續(xù)純化后抗原純度更高，對后續(xù)實驗的影響較小(數(shù)據(jù)未報道)，通過抗原交叉實驗確定了最佳抗原包被劑量(另文報道)。但是仙臺病毒細(xì)胞培養(yǎng)物自身的結(jié)構(gòu)狀態(tài)以及其與酶標(biāo)板底面的吸附性狀仍需關(guān)注。

仙臺病毒是單鏈 RNA病毒，病毒粒子多呈圓形，直徑130～250nm［4］。作為副粘病毒，其與細(xì)胞組分的粘附特性值得關(guān)注。仙臺病毒差速離心后，沉淀物重新懸起需要借助外力，加樣器槍頭吹打的機(jī)械剪切力對沉淀物混勻的效果不佳。使用電動勻漿器對沉淀進(jìn)行勻漿，可以使得沉淀物成為均勻分散相，但進(jìn)行12000r/min的再次離心仍然會有沉淀物存在。這表明差速離心收集的沉淀物中仍有較大團(tuán)塊狀物質(zhì)，這可能是病毒的聚集體，也有可能是病毒與細(xì)胞碎片粘附的團(tuán)塊。這些較大的顆粒狀物質(zhì)在酶標(biāo)板上的吸附穩(wěn)定性較差，使用同一血清樣品在同一酶標(biāo)板的不同孔中讀出的數(shù)值偏差較大，即使進(jìn)行了再次的高速離心這種團(tuán)塊效應(yīng)依然存在。

超聲波細(xì)胞破碎技術(shù)是對生物物質(zhì)均質(zhì)化的另一選擇。超聲對細(xì)胞等生物物質(zhì)的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)可以更好的打開病毒顆粒之間、病毒與細(xì)胞碎片之間的粘附，對沉淀物的均質(zhì)化有一定作用［5］。本文報道了使用超聲波對沉淀物質(zhì)進(jìn)行均質(zhì)化處理，結(jié)果可以看出此處理降低了抗原的團(tuán)塊效應(yīng)對于抗原與酶標(biāo)板吸附的影響，降低了同一樣品在不同孔之間檢測數(shù)值的變異率，提高了酶標(biāo)板吸附抗原的穩(wěn)定性。

［1］實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測［S］.GB14922.2-2001.

［2］侯麗波，謝軍芳，佟巍，等.小鼠仙臺病毒標(biāo)準(zhǔn)化血清的制備及鑒定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(9)：57-59.

［3］Wan CH，Riley MI，Hook RR，et al.Expression of Sendai virus nucleocapsid protein in a baculovirus expression system and application to diagnostic assays for Sendai virus infection［J］.J Clin Microbiol.1995，33(8)：2007-2011.

［4］Megumi T，Nishikawa R，F(xiàn)ujita S，et al.Absorption spectra of viral components of Sendai virus in the wavelength region from 130to 320nm［J］.J Photochem Photobiol B.1991，10(1-2)：79-89.

［5］de Oliveira MZ，Vale V，Keid L，et al.Validation of an ELISA method for the serological diagnosis of canine brucellosis due to Brucella canis［J］.Res Vet Sci.2011，90(3)：425-31.