郭建巍，王珍光，張 云，張雅芳，趙強元，馬 聰

(海軍總醫(yī)院檢驗科，北京 100048)

河豚毒素 (tetrodotoxin，TTX)是一種重要的海洋生物毒素，廣泛存在于海洋生物和陸棲等眾多生物中，并可通過食物鏈富集等途徑污染其它水產(chǎn)品，TTX中毒屢有發(fā)生，死亡率達40%以上。作為一種潛在的軍用毒劑，TTX已被列入國際生物安全公約清單［1］。目前針對 TTX中毒，國內(nèi)外還沒有適用于人體的專用特效藥［2，3］，因此建立和發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗體制劑及檢測方法具有非常重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

河豚毒素(購于河北省水產(chǎn)研究所)；HT、HAT、PEG1500購自Sigma公司；18g～20g Balb/c小鼠由海軍總醫(yī)院實驗動物中心提供；新生小牛血清購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；HRP(RZ≥3.1)及四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(GAM-HRP)由本室制備；Protein A層析柱購自 Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原的制備：河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)15mg溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，緩慢滴加到15mg KLH/0.01mol/L PBS溶液中，調(diào)pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室溫反應(yīng)1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃透析48h，檢測蛋白定量，既得TTX-KLH復(fù)合物即免疫原，分裝后-20℃保存。1.2.2 檢測用抗原的制備：河豚毒素10mg溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到10mg BSA/0.01mol/L PBS溶液中，調(diào)pH至7.0，冰浴下加入1%戊二醛3m L，室溫反應(yīng)1.5h，用0.01mol/L PBS 4℃進行透析48h，既得 TTX-BSA復(fù)合物，分裝后-20℃保存。

1.2.3 抗 TTX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建、篩選和鑒定：選用4～6周齡的雌性 Balb/c小鼠6只，分別用12.5μg TTX-KLH對小鼠腹股溝皮下多點注射免疫，每3周免疫1次，共免疫4次，常規(guī)方法融合。用 TTX-BSA間接 ELISA篩選 ，陽性細(xì)胞反復(fù)亞克隆直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測為100%陽性。于Balb/c小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水，protein A sepharose CL4B親和柱純化，SDS-PAGE、間接ELISA鑒定。

1.2.4 抗TTX單抗的中和活性測定：選用4～6周齡的昆明小鼠100只，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為1mg/m L，用常規(guī)實驗方法檢測TTX的LD50。先將1mg/m L的單抗(對照組用蒸餾水)注入小鼠腹腔，然后注入1.62μg/m L的TTX溶液，72h動態(tài)觀察并記錄小鼠的生存狀態(tài)。

1.2.5 TTX ELISA檢測方法的建立：以40μg/m L BSA-TTX包被酶標(biāo)板，10%FCS PBS過夜封閉。將TTX用 PBS倍比稀釋后分別加入包被好的酶標(biāo)板中，每孔50μL，再加入5μg/m L TTX-McAb每孔50μL，37℃ 1h，洗板后加入1：2000抗鼠二抗，37℃45m in后洗板TMB顯色，酶標(biāo)儀測A450。

2 結(jié)果

2.1 TTX單克隆抗體的純化

用protein A sepharose CL 4B親和柱對所獲得的2株單抗腹水進行了純化，獲得了高純度的IgG如圖1所示。

圖1 TTX單抗的Protein A sepharose CL 4B純化結(jié)果1.穿透峰；2.洗脫峰Fig.1 Purification results of TTX McAb with protein A sepharose CL 4BNote：1.Transmission peak；2.Elution peak

2.2 純化后TTX單抗的SDS-PAGE鑒定

將protein A sepharose CL 4B親和柱純化的單抗體行 SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示抗體純度大于95%(圖2)。

圖2 2株TTX單抗純化后SDS-PAGE結(jié)果1.5E4，2.5E7，3.蛋白質(zhì)Marker，a：重鏈，b：輕鏈Fig.2 SDS-PAGE results of purified TTX McAbs Note：1.5E4；2.5E7；3.Protein marker；a：Heavy chain；b：Light chain

2.3 純化后TTX單抗的間接EL ISA鑒定

用TTX-BSA以40μg/m L包被酶標(biāo)板，常規(guī)間接ELISA檢測，結(jié)果顯示，單抗5E7的結(jié)合能力高于5E4(圖3)。

圖3 2株TTX單抗的活性檢測Fig.3 Detection of the activity of the anti-TTX McAbs

2.4 TTX單抗的中和活性測定

將2μg/m L濃度的TTX 0.5m L分別注入10只昆明小鼠腹腔后，小鼠于30m in內(nèi)全部死亡；分別用2μg/m L、1.8μg/m L、1.6μg/m L、1.4μg/m L、1.48μg/m L、0μg/m L濃度的TTX測得 TTX的LD50為1.62μg/m L。將1mg/m L的TTX單抗(對照組用蒸餾水)0.5mL與1.62μg/mL TTX 0.5m L混合后注入小鼠腹腔，隨時觀察實驗和對照組(各10只)小鼠的狀況，24h后通過不斷追加2μg/m L TTX，每次0.2m L/只，每30min觀察1次，直至對照組小鼠全部死亡，測得當(dāng)對照組小鼠全部死亡時，即2LD50時，TTX單抗對實驗小鼠的保護率為50%。

2.5 TTX的ELISA檢測結(jié)果

用中和性單抗與TTX競爭后加入酶標(biāo)二抗，通過TMB顯色間接測定TTX濃度，從圖4可以看到，TTX濃度與顯色深淺成反比，競爭ELISA測得TTX的最小濃度為1.56μg/m L。

圖4 用競爭ELISA檢測TTXFig.4 Detection of TTX by competitive ELISA

3 討論

TTX是高毒的非蛋白神經(jīng)性海洋生物毒素，人畜中毒死亡率高，目前尚無特效抗毒藥。TTX在軍事上也是潛在的化學(xué)戰(zhàn)劑和實施恐怖活動的毒劑。研制TTX的中和性抗體及檢測方法，在平時和戰(zhàn)時都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

TTX為氨基全羥基喹唑啉化合物，毒性強，分子量小，分子式為C11H17N3O8，主要通過阻滯鈉離子通道，阻斷神經(jīng)肌肉電信號傳導(dǎo)，能夠引起肌肉麻痹和呼吸麻痹，導(dǎo)致人畜死亡［4-6］。作為典型的小分子半抗原(M r=319)，TTX本身無免疫原性。我們用甲醛將TTX與大分子的嗜孔血藍蛋白偶聯(lián)成TTX-KLH，免疫BALB/c小鼠，用TTX-BSA作為檢測抗原，通過將TTX與不同蛋白交聯(lián)，避免了非特異性免疫蛋白的干擾，取得了較好的免疫應(yīng)答及檢測結(jié)果［7］。

昆明小鼠同時腹腔注射LD50劑量的TTX和抗TTX的單抗后，以TTX攻擊。結(jié)果表明，兩株單抗對染毒動物具有一定的保護效果，對2LD50及致死劑量TTX攻擊小鼠的保護率為50%，顯示出良好的抗毒效果。

用中和性抗體作為拮抗劑應(yīng)用的一個最大問題就是，TTX分子量非常小，進入機體后能夠迅速作用于把靶器官，而與之相比，抗體分子量大，穿透力弱，與毒素的結(jié)合需要一個過程，要在短時間內(nèi)阻斷毒素的作用具有一定難度。保護實驗結(jié)果充分說明了這一點，這也是今后其它小分子化合物毒素拮抗劑研究中所面臨的問題。

盡管如此，在目前TTX中毒無任何特效抗毒藥的情況下，我們的實驗結(jié)果無疑展現(xiàn)了希望?；赥TX的中和性抗體，我們建立了檢測 TTX的競爭ELISA方法，此方法檢測TTX的靈敏度為1.56μg/m L，與傳統(tǒng)ELISA的檢測靈敏度相比，仍具一定差距，需要進一步完善。鑒于TTX的小分子特性及與靶器官的快速結(jié)合，阻止其與鈉通道靶位結(jié)合的能力主要決定于親和力及拮抗劑分子量的大小。下一步的工作將是繼續(xù)研制高親和力的優(yōu)質(zhì) TTX小分子拮抗劑，以便實現(xiàn)對TTX中毒的有效保護和急救治療；完善基于TTX中和性抗體的高靈敏度免疫檢測方法，對TTX的快速偵檢具有重要意義。

［1］Chang FC，Bauer RM，Benton BJ et al.4-Aminopyridine antagonizes saxitoxin-and tetrodotoxin-induced cardiorespiratory depression［J］.Toxicon.1996，34(6)：671-90.

［2］Chowdhury FR，Nazmul Ahasan HA，Mamunur Rashid AK，et al. Tetrodotoxin poisoning： a clinical analysis， role of neostigmine and short-term outcome of 53cases［J］.Singapore Med J.2007，48(9)：830-833.

［3］宮慶禮，崔建洲.河豚魚的安全食用研究［J］.衛(wèi)生研究，2003，32(4)：346-348.

［4］Kao CY.Tetrodotoxin，saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomena.Pharmacol Rev［J］.1966，18(2)：997-1049.

［5］宋杰軍，毛慶武.海洋生物毒素學(xué)［M］.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，1996：162-181.

［6］Chang FC， Benton BJ， Salyer JLet al. Respiratory and cardiovascular effects of tetrodotoxin in urethane-anesthetized guinea pigs［J］.Brain Res.1990，528(2)：259-268.

［7］Kawatsu K，Hamano Y，Yoda T et al.Rapid and highly sensitive enzyme immunoassay for quantitative determination of tetrodotoxin［J］.Jpn J Med Sci Biol.1997，50(3)：133-150.