李健 迭敏 周英 呂文彬

WADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)方法的建立*

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目的：建立一種運(yùn)用全自動(dòng)微柱凝膠技術(shù)進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)的方法。方法：采用西班牙Grifols公司W(wǎng)ADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)編制試驗(yàn)程序，通過全自動(dòng)加樣以及孵育、離心等步驟進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)。結(jié)果：根據(jù)試驗(yàn)需要，編制出兩種加樣程序，可以進(jìn)行Rh(D)陰性確認(rèn)和Rh(D)陰性確認(rèn)+抗體篩選兩種試驗(yàn)，通過20份已知Rh(D)血型鑒定和抗體篩選結(jié)果的標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行全自動(dòng)微柱凝膠法以及試管法檢測，兩種方法檢測結(jié)果均一致。結(jié)論：利用WADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)，可以采用全自動(dòng)微柱凝膠技術(shù)進(jìn)行Rh(D)陰性稀有血型確認(rèn)試驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化程度，確保實(shí)驗(yàn)過程更標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀更加客觀，并且可以通過微柱凝膠卡圖像拍攝達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保存信息化。

微柱凝膠技術(shù)； WADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)； 獻(xiàn)血者； Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)

Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)是獻(xiàn)血者Rh血型鑒定中的重要試驗(yàn)。通過該試驗(yàn)可以檢出經(jīng)IgM型抗-D試劑鑒定為陰性，但是用多個(gè)批次或廠家的IgM+IgG型或IgG型抗-D試劑進(jìn)行間接抗球蛋白試驗(yàn)鑒定出現(xiàn)部分或全部結(jié)果陽性的獻(xiàn)血者，這部分獻(xiàn)血者即為Rh(D)變異型，這種血液臨床應(yīng)作為Rh(D)陽性血使用。

目前采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)時(shí)，基本都采用試管法間接抗人球蛋白試驗(yàn)，該方法加樣、孵育、生理鹽水洗滌、離心等步驟均為手工操作，最后由實(shí)驗(yàn)操作者肉眼判讀結(jié)果，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法保存。微柱凝膠技術(shù)(MGIA)是1990年開始應(yīng)用于紅細(xì)胞血型血清學(xué)臨床檢驗(yàn)的，在經(jīng)典抗人球蛋白試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測方法，在國外已成為常用紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測技術(shù)[1]，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)微柱凝膠技術(shù)的優(yōu)勢，結(jié)合WADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)的功能和特點(diǎn)，建立了全自動(dòng)微柱凝膠技術(shù)進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)的方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 西班牙Grifols公司W(wǎng)ADiana全自動(dòng)配血系統(tǒng)。

1.2 試劑 單克隆IgM+IgG抗-D抗體分別購自德國Biotes公司、加拿大Dominion公司、法國Diagast公司、英國Millipore公司(分別以 D1、D2、D3、D4表示)，IgG 抗 -D抗體(以D5表示)、抗人球蛋白試劑和抗體篩選細(xì)胞均購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司，抗球蛋白微柱凝膠卡購自西班牙Grifols公司。

1.3 試驗(yàn)方法編制和設(shè)計(jì) 根據(jù)Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)的特點(diǎn)，其實(shí)質(zhì)是間接抗人球蛋白試驗(yàn)，試驗(yàn)過程中孵育和離心的參數(shù)均與該儀器其他間接抗人球蛋白試驗(yàn)(如交叉配血、抗體篩選)相同，僅僅是加樣的差異。Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)是采用多個(gè)抗-D試劑檢測待檢者紅細(xì)胞上是否有D抗原。由于Rh(D)陰性獻(xiàn)血者通常受免疫刺激產(chǎn)生ABO以外抗體的幾率比Rh(D)陽性獻(xiàn)血者高[2-3]，因此通常在進(jìn)行獻(xiàn)血者Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)的同時(shí)，也對其進(jìn)行抗體篩選試驗(yàn)，以避免含有ABO以外抗體的血液產(chǎn)品發(fā)放到臨床使用。

在加樣程序設(shè)計(jì)中，待檢者紅細(xì)胞均為儀器吸取全血標(biāo)本管中壓積紅細(xì)胞自動(dòng)稀釋為濃度0.8%、加樣50 ul，篩選細(xì)胞為已配置好0.8%濃度、加樣50 ul，待檢者血漿和抗-D試劑加樣量均為25 ul。編輯Rh(D)陰性確認(rèn)(Rh Neg)和Rh(D)陰性確認(rèn)+抗體篩選(Rh Neg+Anti Scr)這兩個(gè)試驗(yàn)程序，以滿足不同試驗(yàn)要求所需。具體流程為：

1.3.1 Rh Neg每個(gè)待檢者檢測需要5孔微柱凝膠孔，加樣時(shí)分別在五孔中均先加好各自對應(yīng)待檢者紅細(xì)胞，在每個(gè)待檢者的第1孔中加入D1→第2孔中加入D2→……→第5孔中加入D5，加樣結(jié)束即進(jìn)入孵育、離心、結(jié)果判讀。

1.3.2 Rh Neg+Anti Scr 試驗(yàn)每個(gè)待檢者需要8孔，每個(gè)標(biāo)本檢測需要一張完整WADiana微柱凝膠抗人球卡。加樣依次為每張卡前三孔依次加入抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細(xì)胞→每個(gè)待檢者血漿分別加入對應(yīng)卡的這三孔→待檢者紅細(xì)胞加入對應(yīng)卡的后五孔→每張卡后面五孔依次加上D1、D2、D3、D4、D5，加樣結(jié)束即進(jìn)入孵育、離心、結(jié)果判讀。

以上兩個(gè)試驗(yàn)，針對Rh(D)結(jié)果判讀規(guī)則均設(shè)置為D1、D2、D3、D4、D5全陰性，該獻(xiàn)血者定為Rh(D)陰性，若其中任一試劑或一個(gè)以上試劑為陽性結(jié)果，該獻(xiàn)血者則定為Rh(D)陽性。在Rh Neg+Anti Scr中，若抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔出現(xiàn)1個(gè)或者1個(gè)以上陽性，表示該獻(xiàn)血者抗體篩選試驗(yàn)陽性，應(yīng)進(jìn)一步復(fù)查，以確定其陽性結(jié)果由獻(xiàn)血者標(biāo)本抗凝效果所致或是獻(xiàn)血者血漿中含有ABO以外抗體。

試驗(yàn)方法編輯完成后，用獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行模擬加樣測試，將所有試劑、抗人球卡及標(biāo)本放置好后，開始運(yùn)行試驗(yàn)程序，密切觀察儀器運(yùn)行，加樣完全按照設(shè)計(jì)流程進(jìn)行，加樣后按照規(guī)定時(shí)間和程序孵育、離心、結(jié)果判讀，證明方法編輯正確。

2 結(jié)果

取20份已知Rh(D)血型鑒定和抗體篩選結(jié)果的標(biāo)本進(jìn)行檢測，其結(jié)果與試管法檢測結(jié)果均一致。

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是目前被國際輸血協(xié)會(huì)確認(rèn)的29個(gè)血型系統(tǒng)中最具復(fù)雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng)，也是臨床上僅次于ABO系統(tǒng)的重要血型系統(tǒng)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)48個(gè)抗原，其中D抗原性最強(qiáng)，與臨床輸血關(guān)系最密切[4]。正常的D抗原是由10個(gè)外顯子決定的至少9個(gè)抗原表位組成的嵌合體，如果缺乏或被其他基因錯(cuò)代了其中一種以上的因子時(shí)，稱為D變異型。D變異型用普通的IgM型抗-D直接鑒定常常為陰性，但是采用不同的IgM+IgG型或IgG型抗-D進(jìn)行抗球蛋白試驗(yàn)鑒定，則可能出現(xiàn)1種或1種以上的試劑結(jié)果為陽性。D變異型患者若接收了Rh(D)陽性血，可能產(chǎn)生抗-D抗體，因此應(yīng)接收Rh(D)陰性血；但是，D變異型作為獻(xiàn)血者，因其血液輸入Rh(D)陰性患者體內(nèi)，也可能刺激患者產(chǎn)生抗-D抗體，故該血液應(yīng)作為Rh(D)陽性血發(fā)往臨床使用。所以若需輸血的患者Rh(D)抗原檢測僅需要IgM型抗-D進(jìn)行初步鑒定即可，凝集者為Rh(D)陽性，不凝集者為Rh(D)陰性；而獻(xiàn)血者在IgM型抗-D進(jìn)行初步鑒定為陰性后，進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)顯得非常重要，根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求[5]，需用3~5個(gè)不同廠家或不同批號(hào)的抗-D試劑，采用抗人球蛋白試驗(yàn)或酶試驗(yàn)，受檢紅細(xì)胞與各批抗-D試劑均不凝集者，才能定為Rh(D)陰性獻(xiàn)血者。同時(shí)，由于Rh(D)陰性個(gè)體經(jīng)由輸血或者懷孕等免疫刺激后，產(chǎn)生抗體的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Rh(D)陽性個(gè)體，因此在進(jìn)行Rh(D)陰性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)時(shí)往往對獻(xiàn)血者進(jìn)行抗體篩選試驗(yàn)，以避免抗體篩選陽性的血液被發(fā)往臨床引起交叉配血不合，保證臨床用血的安全有效。

目前采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行Rh(D)陰性確認(rèn)、抗體篩選時(shí)，普遍采用試管法間接抗球蛋白試驗(yàn)，該方法為手工操作，每個(gè)標(biāo)本檢測都需要用多只試管，需經(jīng)手工加樣、孵育、生理鹽水反復(fù)洗滌、離心等步驟，最后由實(shí)驗(yàn)操作者肉眼判讀結(jié)果，試驗(yàn)人員的工作強(qiáng)度大，結(jié)果判斷主觀性大，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法保存，急需通過尋求自動(dòng)化操作方法，減少試驗(yàn)過程的人為誤差，降低工作人員勞動(dòng)強(qiáng)度，確保實(shí)驗(yàn)過程更易標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀更加客觀。根據(jù)目前的技術(shù)發(fā)展，只有微柱凝膠技術(shù)(MGIA)能達(dá)到和實(shí)現(xiàn)上述要求。MGIA是1990年開始應(yīng)用于紅細(xì)胞血型血清學(xué)臨床檢驗(yàn)的，經(jīng)典抗人球蛋白試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測方法，在國外已成為常用紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測技術(shù)，其具有操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、標(biāo)本用量少、結(jié)果可長期保存等優(yōu)點(diǎn)[6]。目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于血型鑒定、不規(guī)則抗體篩查、交叉配血及直接、間接抗人球蛋白試驗(yàn)中。

WADiana全自動(dòng)血型/配血儀是由西班牙Grifols公司開發(fā)的，基于微柱凝膠技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制操作進(jìn)行血型血清學(xué)試驗(yàn)的自動(dòng)化儀器。該儀器通常的檢測程序有ABO正反定型、Rh(D)定型(IgM型試劑)、Rh表現(xiàn)型鑒定(C、c、E、e抗原)、抗體篩選和抗體鑒定、交叉配血，新生兒溶血病檢測等，可以滿足大部分的血型血清學(xué)檢測需要，但并無采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行Rh(D)陰性確認(rèn)試驗(yàn)的程序和方法。本文介紹了WADiana在獻(xiàn)血者Rh(D)陰性稀有血型確認(rèn)試驗(yàn)中應(yīng)用的方法。采用此方法，可以同時(shí)進(jìn)行Rh(D)陰性稀有血型確認(rèn)試驗(yàn)及抗體篩選試驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化程度，確保實(shí)驗(yàn)過程更易標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀更加客觀，并且可以通過微柱凝膠卡圖像拍攝達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保存信息化。該方法所得結(jié)果是否與手工試管法檢測結(jié)果完全一致，能否完全替代手工試管法，還需進(jìn)行大批量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測，進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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[3] 馬宏偉，謝輝.鄭州市Rh陰性獻(xiàn)血者血清學(xué)表型和不規(guī)則抗體調(diào)查[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，14(3)：276-277.

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10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.040

成都市衛(wèi)生局2011年青年基金科研課題(編號(hào)：201135)

①成都市血液中心 四川 成都 610041

李健

2012-04-23) (本文編輯：李靜)