劉軍山+張洋洋+王忠+鄧嘉翌+葉軒+薛日野+葛丹+徐征

摘 要 設計并驗證了一種用于細胞三維培養(yǎng)的集成微柱陣列的微流控芯片。芯片由一片聚二甲基硅氧烷（PDMS）溝道片和一片玻璃蓋片組成， 在PDMS溝道片上集成了一個由兩排微柱陣列圍成的細胞培養(yǎng)室和兩條用于輸送培養(yǎng)基的側溝道。微柱間距直接影響了芯片的使用性能， 是整個芯片設計的關鍵?；跀?shù)值模擬和實驗驗證， 本研究對微柱間距進行了優(yōu)化設計。優(yōu)化后的微流控芯片可以很好地實現(xiàn)細胞與細胞外基質模擬材料混合液的穩(wěn)定注入、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質向培養(yǎng)室內的快速擴散和細胞代謝物的及時排出。在芯片上進行了神經干細胞的三維培養(yǎng)， 證明了芯片上構建的細胞體外微環(huán)境的穩(wěn)定性。

關鍵詞 微流控芯片； 細胞； 三維培養(yǎng)； 微柱； 聚二甲基硅氧烷

1 引 言

微流控芯片具有試劑消耗量少、易于精確控制液體流動和模擬構建細胞體外微環(huán)境等優(yōu)點， 在細胞分析領域得到了廣泛應用[1～3]。近年來， 基于微流控芯片的細胞分析研究主要包括：單細胞操控與分析[4]、細胞與細胞[5]及細胞與細胞外基質的相互作用[6]、干細胞誘導與分化[7]、藥物篩選[8]和器官芯片[9]等， 而細胞培養(yǎng)是開展上述研究的基礎。

微流控芯片上的細胞培養(yǎng)有二維和三維兩種方式。二維培養(yǎng)操作簡單， 但最近研究表明， 細胞在二維培養(yǎng)環(huán)境中無法真實體現(xiàn)其在體內的生物學特性和功能[10]。在微流控芯片上進行細胞三維培養(yǎng)的主要方法是將細胞與細胞外基質模擬材料（例如膠原蛋白）混合， 然后將混合液注入到細胞培養(yǎng)室中， 為細胞搭建一個三維培養(yǎng)空間， 通過微溝道與培養(yǎng)室連接， 為細胞持續(xù)提供培養(yǎng)基[5，11]。

芯片上的細胞培養(yǎng)室多數(shù)采用一種四周封閉、只有一個入口和一個出口的圓池形結構[12]。這種結構雖然制作簡單， 但能夠實現(xiàn)的功能有限， 而且在輸送培養(yǎng)基時會產生較大剪切力， 對細胞造成傷害[13]。Toh等[14]提出了一種由兩排微柱陣列圍成的培養(yǎng)室結構， 這種結構既可實現(xiàn)多種復雜功能， 又避免了培養(yǎng)基直接從細胞表面流過， 可大幅減小細胞所受的剪切力， 此種培養(yǎng)室得到了越來越多應用[15]。然而， 有關此類型芯片的優(yōu)化設計卻鮮見報道。微柱間距直接影響芯片使用性能， 間距過大， 在注入細胞與細胞外基質模擬材料混合液時， 混合液會克服流動阻力流出培養(yǎng)室， 使得芯片無法正常工作； 間距過小， 既會增加芯片制作難度， 又會降低培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質和細胞代謝物的擴散速度， 影響細胞正常生長[16，17]。

本研究基于數(shù)值模擬和實驗驗證， 對微流控芯片上的微柱間距進行了優(yōu)化設計， 并在優(yōu)化后的芯片上進行了神經干細胞三維培養(yǎng)， 檢測了構建的細胞體外微環(huán)境穩(wěn)定性。

2 實驗部分

2.1 微流控芯片設計

微流控芯片結構如圖1所示， 由一片聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）溝道片（40 mm×20 mm×3 mm）和一片玻璃蓋片（50 mm×24 mm×0.15 mm）組成。在溝道片上， 集成了一個由兩排微柱陣列圍成的細胞培養(yǎng)室、兩條用于輸送培養(yǎng)基的側溝道和6個儲液池。微柱陣列長20 mm， 兩排微柱之間距離為1 mm， 微柱直徑為100 μm、高150 μm。側溝道寬1 mm、深150 μm， 儲液池直徑為3 mm。

本研究組曾利用鼠尾I型膠原構建了神經干細胞的三維培養(yǎng)微環(huán)境[18]， 因此本研究所用細胞外基質模擬材料均為鼠尾I型膠原。芯片操作流程如下：首先利用移液器將細胞與膠原混合液從細胞入口注入培養(yǎng)室， 接著將芯片放入細胞培養(yǎng)箱中使膠原溶液聚合形成水凝膠， 然后采用微量注射泵將培養(yǎng)基從兩個培養(yǎng)基入口注入側溝道， 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質通過擴散方式經過微柱陣列進入培養(yǎng)室， 同時細胞代謝物也通過擴散方式排出培養(yǎng)室。

2.2 微流控芯片數(shù)值模擬

基于計算流體動力學， 對不同微柱間距情況下膠原溶液的注入過程和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的擴散過程進行了數(shù)值模擬。

首先， 基于COMSOL Multiphysics的兩相流水平集模型， 模擬膠原溶液注入過程。由于側溝道和培養(yǎng)室沿著芯片水平中心線對稱分布， 而且微柱等間距排列， 因此為減少仿真工作量， 建立了一個簡化的軸對稱二維幾何模型（圖2A）。

影響細胞與膠原混合液注入過程的主要參數(shù)包括：混合液粘度和表面張力系數(shù)、注入壓力、微溝道表面接觸角、微柱間距等。膠原溶液濃度為1 mg/mL， 利用流變儀測得的粘度為0.032 Pa·s， 利用接觸角測量儀測得的表面張力系數(shù)為44 mN/m。混合液注入壓力設定為1 kPa， 由于微溝道出口與外界大氣相通， 因此出口壓力設定為0。為了提高芯片鍵合強度和微溝道表面親水性， 在芯片鍵合前， 利用等離子體對PDMS溝道片表面進行改性處理。測得膠原溶液在改性后的PDMS表面上接觸角為30°， 因此設定微溝道表面接觸角為30°。微柱間距共設計了4種， 分別為30、50、80和100 μm。

其次， 基于ANSYS Fluent的組分輸運模型， 模擬營養(yǎng)物質擴散過程。同樣， 建立一個簡化的軸對稱三維幾何模型（圖2B）。影響營養(yǎng)物質擴散過程的主要參數(shù)包括：營養(yǎng)物質的濃度和擴散系數(shù)、培養(yǎng)基流速、培養(yǎng)室內水凝膠的孔隙率和滲透率、微柱間距等。葡萄糖是培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物質， 在進行神經干細胞培養(yǎng)時， 葡萄糖濃度為50.83 mmol/L， 遠高于其它營養(yǎng)物質的濃度， 因此選用50.83 mmol/L葡萄糖溶液作為模擬培養(yǎng)基。在37℃（細胞培養(yǎng)時的溫度）時， 葡萄糖在培養(yǎng)基中擴散系數(shù)為9.6×1010 m2/s [19]。微量注射泵的流量設定為1 μL/min， 換成培養(yǎng)基的流速為5.56×105 m/s。 利用排液法， 測得水凝膠孔隙率為0.99， 滲透率設定為2×109 cm2[20]。設計了3種微柱間距， 分別為5、50和100 μm。

2.3 微流控芯片制作

PDMS具有良好的生物兼容性、透光性和透氣性， 被廣泛用于制作各種細胞分析微流控芯片[7，9]。采用澆注成型的方法制作PDMS溝道片 [16]， 然后利用等離子體清洗機對PDMS溝道片和玻璃表面進行氧等離子體處理，然后對準鍵合在一起。

2.4 儀器與試劑

K1050X等離子體清洗機（英國Quorum公司）； STM6工具顯微鏡（日本Olympus公司）； IX71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）； PHD 22/2000微量注射泵（美國Harvard公司）； Sunrise酶標儀（奧地利Tecan公司）； DSA100接觸角測量儀（德國Krüss公司）； AR2000ex流變儀（美國TA公司）。

鼠尾I型膠原（生友生物技術有限公司）； 熒光素鈉（天津市大茂化學試劑廠）； 葡萄糖和乳酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究）； 碘化丙啶（Propidium iodide， PI， Sigma公司）； 鈣黃綠素AM（CalceinAM， Sigma公司）； PDMS（Dow Corning公司）。

3 結果與討論

3.1 數(shù)值模擬

在不同微柱間距情況下， 膠原溶液的流動過程如圖3所示。膠原溶液的注入過程是壓力、毛細力和表面張力共同作用的結果[21]。在培養(yǎng)室內， 壓力和毛細力起主要作用， 膠原溶液流動迅速， 僅用1 ms便充滿了培養(yǎng)室。然而， 在微柱之間， 膠原溶液受到粘性力和表面張力的阻滯作用， 流速明顯衰減。當微柱間距為30和50 μm時， 即使經過1000 ms膠原溶液仍停留在微柱之間， 沒能進入側溝道。隨著微柱間距增大， 這種阻滯作用逐漸減弱， 膠原溶液有突破微柱束縛進入側溝道的趨勢。當微柱間距為80 μm時， 經過1000 ms膠原空氣界面已明顯越過圓柱中心線。當間距繼續(xù)增大到100 μm時， 膠原溶液克服了阻滯作用， 在200 ms時膠原空氣界面進入側溝道， 在1000 ms時溶液充滿側溝道。

圖4顯示了微柱間距為50 μm時， 葡萄糖濃度在芯片內隨時間的變化情況。葡萄糖溶液在側溝道中流動迅速， 僅用18 s便到達了側溝道出口。同時， 葡萄糖會經過微柱陣列向培養(yǎng)室內擴散， 在220 s時擴散過程達到平衡， 濃度在芯片內達到了均勻分布。當微柱間距為5和100 μm時， 葡萄糖濃度達到均勻分布所用的時間分別為237和200 s， 二者相差約40 s。因此， 微柱間距會影響營養(yǎng)物質向培養(yǎng)室內的擴散速度。

結合上述兩方面數(shù)值模擬結果， 在綜合考慮芯片加工難度和使用性能的情況下， 最終選擇50 μm作為微柱間距的最優(yōu)值。之后如無特殊說明， 芯片上微柱間距均為50 μm。

3.2 實驗驗證

在優(yōu)化后的微流控芯片上對膠原溶液注入過程進行實驗驗證。采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）將5 mg/mL膠原溶液稀釋到1 mg/mL， 用0.1 mol/L NaOH溶液將pH值調節(jié)為中性。然后將20 μL膠原溶液從細胞入口注入培養(yǎng)室。膠原溶液5 s便充滿了培養(yǎng)室， 但一直到30 min后仍未突破微柱束縛進入側溝道， 在微柱之間形成了一個穩(wěn)定的膠原空氣界面（圖5）。

對營養(yǎng)物質擴散過程進行實驗驗證。熒光素鈉擴散系數(shù)為4.3×1010 m2/s[22]， 與數(shù)值模擬時用到的葡萄糖擴散系數(shù)相近， 為了在顯微鏡下清楚觀測到擴散過程， 采用20 μmol/L熒光素鈉溶液代替葡萄糖溶液。利用微量注射泵將熒光素鈉溶液從培養(yǎng)基入口注入側溝道， 流速為0.5 μL/min， 每隔500 ms拍攝一次照片。熒光素鈉的流動與擴散過程與葡萄糖溶液的數(shù)值模擬結果類似， 僅用5 s便充滿了側溝道， 同時經過微柱陣列向培養(yǎng)室內不斷擴散， 在160 s時擴散過程達到平衡（圖6）。

上述結果表明， 利用數(shù)值模擬優(yōu)化出的微柱間距不僅可以很好地實現(xiàn)細胞與細胞外基質模擬材料混合液的穩(wěn)定注入， 有效攔截了混合液向側溝道中的泄漏， 而且保證了營養(yǎng)物質可以快速擴散到培養(yǎng)室內， 滿足了芯片性能要求。

3.3 芯片上的微環(huán)境穩(wěn)定性測試

在細胞培養(yǎng)過程中， 體外微環(huán)境的穩(wěn)定性至關重要， 除了要保持營養(yǎng)物質含量的穩(wěn)定， 細胞代謝產物也應及時排出。例如乳酸是葡萄糖主要代謝副產物， 乳酸的積累會改變微環(huán)境pH值， 對細胞有毒害作用， 因此希望能夠維持在較低濃度[17]。

神經干細胞具有自我更新、多向分化等能力， 已成為神經組織工程等領域的研究熱點[23]。本研究通過神經干細胞的三維培養(yǎng)， 測試優(yōu)化設計的微流控芯片所構建的微環(huán)境穩(wěn)定性。

原代神經干細胞取自孕齡為14 天的昆明種小鼠胎腦的海馬組織， 待培養(yǎng)至第三代時與膠原溶液混合， 形成細胞密度為1×106 cells/mL的混合液[18]。共制作了3片微流控芯片， 用于培養(yǎng)神經干細胞。同時， 為了對比分析， 在96孔板的3個孔中靜態(tài)培養(yǎng)神經干細胞， 每個孔中加入50 μL細胞與膠原混合液， 待膠原聚合后加入100 μL培養(yǎng)基， 每24 h更換50 μL培養(yǎng)基。

每隔12 h從芯片廢液池和96孔板中取出10 μL培養(yǎng)基， 對其中的葡萄糖和乳酸濃度進行檢測（圖7）。如圖7A所示， 葡萄糖初始濃度為50.83 mmol/L， 由于細胞消耗， 芯片上的葡萄糖濃度會略有下降， 但如3.2節(jié)所述， 葡萄糖可以快速擴散到培養(yǎng)室內， 所以濃度仍然可以保持很高， 一直穩(wěn)定在48～50 mmol/L。相反， 由于96孔板是靜態(tài)培養(yǎng)， 在每個換液周期內營養(yǎng)物質得不到補充， 因此葡萄糖濃度持續(xù)下降， 最低降至41 mmol/L。從圖7B可見， 由于芯片上的細胞代謝物可以通過擴散方式快速排出培養(yǎng)室， 因此培養(yǎng)基中的乳酸濃度很低， 在0.6～0.8 mmol/L之間。而在96孔板中， 由于乳酸在每個換液周期內持續(xù)積累， 所以濃度一直很高， 即使在換液后也無法有效降低， 始終保持在2.4 mmol/L以上， 最高達到4.3 mmol/L。

從葡萄糖和乳酸濃度的長期檢測結果可知， 與96孔板中靜態(tài)培養(yǎng)相比， 由本研究優(yōu)化設計的微流控芯片構建的微環(huán)境具有更好的穩(wěn)定性， 可用于細胞長期培養(yǎng)。

培養(yǎng)到第8天， 對神經干細胞進行在線死活熒光染色（圖8）。與96孔板相比， 芯片上的干細胞突起更為明顯， 突觸間相互連接， 向三維空間縱深。根據隨機選取的10張不同區(qū)域下的照片， 對死活細胞進行了計數(shù)， 芯片上和96孔板中的細胞存活率分別約為90%和82%。

4 結 論

利用數(shù)值模擬和實驗驗證相結合的方法， 對集成微柱陣列的微流控芯片進行了優(yōu)化設計。利用優(yōu)化后的微流控芯片， 進行了神經干細胞的三維培養(yǎng)。對葡萄糖和乳酸濃度進行了長期連續(xù)檢測， 結果表明， 由本研究優(yōu)化設計的微流控芯片所構建的細胞體外微環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性， 適合于細胞長期三維培養(yǎng)， 未來可以用于各種細胞分析研究。

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