冀章章 夏 榮 梅陵宣

1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，安徽合肥230601；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，安徽合肥230032

牙齒發(fā)育是由牙源性上皮與顱神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)相互作用的結(jié)果，研究表明一些生物信號(hào)分子在牙胚發(fā)育過(guò)程中呈時(shí)空特異性表達(dá)，并相互作用，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，決定牙胚發(fā)育的進(jìn)程。在此階段機(jī)體攝入過(guò)量的氟會(huì)損傷成釉細(xì)胞，引起牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使氟牙癥的形成[1]，骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）作為牙齒發(fā)育階段的重要信號(hào)分子，其特異性發(fā)生機(jī)制目前尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究小鼠下頜第一磨牙牙胚內(nèi)分泌期和成熟期成釉細(xì)胞形態(tài)改變及BMP-2的表達(dá)，探討氟引起牙釉質(zhì)發(fā)育障礙的可能原因。

1 材料與方法

1.1 一般材料

32只4日齡的ICR小鼠（安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)），BMP-2單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)），SP法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑（北京中杉公司），微量移液加樣器（50μL，中國(guó)），Nikon eclipase 80i顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)（Nikon公司，日本），RM2245切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 分組 按照隨機(jī)抽取及分配的原則，分別從8只母鼠窩內(nèi)抽取32只4日齡的ICR小鼠（雌雄各半），根據(jù)單次腹腔注射氟劑量的不同，平均分成兩組，每組16只，各組再平均分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。將10 mg/kg（體重）（實(shí)驗(yàn)組1）和20 mg/kg（體重）（實(shí)驗(yàn)組2）的NaF分別單次注入實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔內(nèi)，將等劑量的NaCl分別單次注入對(duì)照組動(dòng)物腹腔內(nèi)，注射量均為10μL/g，完成后所有動(dòng)物返回各自母親。在實(shí)驗(yàn)前后監(jiān)測(cè)所有動(dòng)物體重，分析不同濃度氟對(duì)體重變化的可能影響。

1.2.2 標(biāo)本處理 所有小鼠在藥物注射24 h后被斷頸處死，含有下頜第1磨牙牙胚的下頜骨被分離并取出（其上不含有軟組織），立刻將其置于4%多聚甲醛液（4℃，現(xiàn)用現(xiàn)配）中固定24 h；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋；從近遠(yuǎn)中向沿頰面4μm連續(xù)切片，以多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，在60℃烤箱中烤片12 h，備用。

1.2.3 HE染色 采用常規(guī)HE染色含有小鼠下頜第1磨牙牙胚的下頜骨，在光鏡下觀察不同發(fā)育階段成釉細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.4 免疫組化染色 采用SP法。室溫下切片脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3% H2O2室溫下孵育10 min，0.01 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3～5 min，甩去多余液體。滴加抗原修復(fù)，正常羊血清工作液封閉，室溫下10 min，傾去勿洗，滴加BMP-2單克隆抗體（1︰300），4℃濕盒過(guò)夜，PBS沖洗3～5 min（以0.01 mol/L PBS液代替一抗作陰性對(duì)照）。室溫下復(fù)溫半小時(shí)，滴加生物素標(biāo)記二抗試劑，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3～5 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的工作液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3～5 min。DAB/ H2O2反應(yīng)染色，蒸餾水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。將免疫組化染色結(jié)果在JEDA 810D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行灰度分析，BMP-2陽(yáng)性染色為棕黃色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)注射藥物24 h后的所有動(dòng)物體重進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析（ANOVA）灰度值。

2 結(jié)果

2.1 藥物注射結(jié)果

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未見(jiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的體重在注射藥物24 h后的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 藥物注射24 h后動(dòng)物的體重比較（±s，g）

表1 藥物注射24 h后動(dòng)物的體重比較（±s，g）

藥物劑量 對(duì)照組（NaCl） 實(shí)驗(yàn)組（NaF） tP 10 mg/kg 20 mg/kg 0.117 0.815 3.626±0.149 3.658±0.121 3.728±0.085 3.673±0.131 1.669 0.238

2.2 HE染色結(jié)果

對(duì)照組：處于分泌階段的成釉細(xì)胞中細(xì)胞核遠(yuǎn)離基底膜，呈高柱狀整齊均勻排列，托姆斯突在靠近釉質(zhì)-牙本質(zhì)側(cè)形成，紅染的釉基質(zhì)均勻分布；處于過(guò)渡階段的成釉細(xì)胞形態(tài)顯著變短，其中包含退縮的托姆斯突；處于成熟階段的成釉細(xì)胞形態(tài)由高柱狀逐漸向矮立方狀轉(zhuǎn)化。

實(shí)驗(yàn)組：氟引起的改變?cè)趦山M中幾乎相同，囊腔樣損害形成于部分分泌期和過(guò)渡期的成釉細(xì)胞下方，囊腔上方的成釉細(xì)胞高度變矮，正常的柱狀結(jié)構(gòu)喪失，扭曲變性，伴有不同程度的空泡性變，托姆斯突排列紊亂甚至消失，囊腔下方相對(duì)的部分釉質(zhì)表面出現(xiàn)不規(guī)則的陽(yáng)性改變，但這些損害被限制在相對(duì)孤立的區(qū)域，兩組中成熟期成釉細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的釉質(zhì)未發(fā)現(xiàn)組織學(xué)上的異常。見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組磨牙組織學(xué)觀察（×400）

2.3 免疫組化染色結(jié)果

對(duì)照組中，BMP-2表達(dá)在牙乳頭細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞、中間層細(xì)胞及成釉細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，分泌期和過(guò)渡期的成釉細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱。見(jiàn)圖2。

運(yùn)用成像系統(tǒng)分析標(biāo)本玻片圖像的鏡下結(jié)果，量化后通過(guò)ANOVA檢驗(yàn)不難看出，成熟期組P＞0.05，未見(jiàn)明顯變化，而隨著氟濃度的升高，BMP-2的表達(dá)逐漸減弱，二者呈負(fù)相關(guān)，且P值在分泌期和過(guò)渡期組中均＜0.01。見(jiàn)表2。

圖2 實(shí)驗(yàn)組BMP-2在相關(guān)組織中的表達(dá)（×400）

表2 不同分化時(shí)期的成釉細(xì)胞中BMP-2表達(dá)情況比較（±s）

表2 不同分化時(shí)期的成釉細(xì)胞中BMP-2表達(dá)情況比較（±s）

分組 分泌期 過(guò)渡期 成熟期對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2 FP 133.313±4.949 161.750±4.132 203.875±2.997 704.151 0.000 141.063±4.553 166.500±4.721 206.875±3.643 600.234 0.000 154.688±7.181 159.000±7.616 159.500±4.504 1.838 0.177

3 討論

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）最初被認(rèn)為是具有骨誘導(dǎo)性的一種高效充質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化形成軟骨及骨組織，在之后的研究過(guò)程中人們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它是一組多功能生長(zhǎng)因子，通過(guò)刺激新骨的形成和在上皮-間充質(zhì)中傳遞信號(hào)等方式影響器官功能發(fā)育[2]。BMPs是與骨和牙齒形成相關(guān)的生長(zhǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族，在機(jī)體多種組織和器官的形態(tài)發(fā)生中起重要調(diào)控作用。在牙髓生物學(xué)領(lǐng)域，在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙髓損傷修復(fù)中，BMP-2作為上皮間充質(zhì)之間的一種信號(hào)分子，通過(guò)細(xì)胞黏附分子、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮一定的作用[3-5]。Nadiri A[6]發(fā)現(xiàn)，BMP-2不僅在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化階段大量表達(dá)，而且在鼠牙胚發(fā)生和早期發(fā)育階段有表達(dá)且與BMP-4關(guān)系密切，二者共同參與調(diào)控同源盒轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，BMP-2、BMP-4同時(shí)短暫表達(dá)于成牙釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中。Miyoshi K[7]認(rèn)為，BMP-2 mRNA在帽狀期首先被檢測(cè)出來(lái)，胚胎發(fā)育的第14天（E14），牙尖部的內(nèi)釉上皮細(xì)胞中局限表達(dá)，在上皮中的轉(zhuǎn)錄2 d后喪失，隨后在牙乳頭的間充質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，鐘狀期、E17～E18，BMP-2 mRNA仍然表達(dá)于牙髓干細(xì)胞，此為牙乳頭的中心細(xì)胞，到了成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞分化終末這種表達(dá)形式才消失。前成牙本質(zhì)細(xì)胞分化終末期時(shí)BMP-2 mRNA出現(xiàn)，其表達(dá)進(jìn)一步增加于成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌期，并且一直存在于這些細(xì)胞中直到出生后4 d。

學(xué)者們通過(guò)研究認(rèn)為，氟斑牙的發(fā)生是由于在牙齒發(fā)育期間機(jī)體攝入過(guò)量氟所致，相關(guān)的形成機(jī)制主要有生物個(gè)體的差異；處于敏感階段的成釉細(xì)胞暴露在高濃度的氟中，使得后續(xù)形成的釉質(zhì)蛋白的降解和移除被延緩，釉基質(zhì)蛋白水解酶的分泌和活性降低，從而清除釉基質(zhì)的時(shí)間延長(zhǎng)；氟對(duì)羥基磷灰石晶體的影響等[8-10]。本實(shí)驗(yàn)筆者選擇4～5日齡小鼠第一磨牙牙胚為研究模型，可以同時(shí)觀察到作為釉質(zhì)形成唯一的上皮源性細(xì)胞——成釉細(xì)胞處于分泌期，過(guò)渡期和成熟期等不同的分化階段，經(jīng)歷增殖、分化以及形態(tài)功能的演變，并且與切牙相比，第一磨牙是有限生長(zhǎng)的，與人類牙齒更接近。

通過(guò)連續(xù)切片可以看出：對(duì)于釉質(zhì)的正常形成起著決定性作用的部分成釉細(xì)胞下相對(duì)存在囊腔樣損害，受侵襲的程度以靠近囊腔的細(xì)胞最嚴(yán)重，對(duì)F-的敏感性隨著成釉細(xì)胞處于不同的分化階段而改變，這些形態(tài)學(xué)上的不利影響在處于成熟階段的成釉細(xì)胞中幾乎未見(jiàn)。筆者推測(cè)：本實(shí)驗(yàn)藥物濃度條件下，在注射藥物24 h內(nèi)，成釉細(xì)胞形態(tài)上的明顯差異未曾發(fā)生，或是這些細(xì)胞發(fā)育時(shí)序相同，即由分泌階段向過(guò)渡階段轉(zhuǎn)化。這與Hirota L等的研究結(jié)果部分一致，他們認(rèn)為攝入過(guò)量的氟很難對(duì)處于成熟期成釉細(xì)胞產(chǎn)生影響，卻能夠造成分泌期成釉細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體的膨脹損傷，異位物質(zhì)壓迫托姆絲突致使紊亂、使得細(xì)胞的水腫變性、空泡形成成為可能[11]。

筆者認(rèn)為可能在過(guò)量氟的影響下， BMP-2蛋白的表達(dá)被抑制， 進(jìn)而引起成釉細(xì)胞的分化和隨后的基質(zhì)分泌功能低下，細(xì)胞形態(tài)和功能上的改變發(fā)生于分泌期和過(guò)渡期，造成功能性細(xì)胞數(shù)量減少，從而使得釉質(zhì)發(fā)育障礙，導(dǎo)致了氟斑牙的形成。這可能是高氟致使釉質(zhì)發(fā)育缺陷的機(jī)制之一。

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