劉 沖 趙浩亮

1.太原市中心醫(yī)院普外一科，山西太原 030009；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001

原發(fā)性肝癌（PHC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅著人類的健康，因此尋找一種合理有效的治療方案則具有重大的意義。隨著基因工程技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，以免疫治療為基礎(chǔ)的生物治療及分子靶向藥物治療越來越受到關(guān)注，并逐漸成為肝癌治療的重要手段，為肝癌的治療提供了新思路[1]。索拉菲尼（sorafenib）是首個(gè)口服的多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，作為第1個(gè)在肝癌治療中獲得優(yōu)勢生存的靶向藥物，已被美國食品與藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）確定用于肝癌患者的治療。周期素依賴性激酶5（CDK5）是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白（CDK）家族中的一員，它通過影響細(xì)胞增殖和凋亡異常而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)觀察索拉菲尼在體外對人肝癌HepG2細(xì)胞株的抑制作用及其對CDK5表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 接種細(xì)胞 人肝癌HepG2細(xì)胞株：購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基（武漢博士德公司，批號：PYG0035）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號：040622）；二甲基亞楓（DMSO，南京賽泓瑞生物科技有限公司，批號：D-5879）及四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司，批號：298-93-1）；索拉菲尼（Sorafenib，德國拜耳公司，批號： FS10807 ）；兔抗人CDK5多克隆抗體和羊抗兔抗體（ 二抗） （美國Santa Cruz公司，批號：sc-173）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌hepG2細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，2 d傳代1次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測索拉菲尼對HepG2細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h后加入藥物。實(shí)驗(yàn)分成4組：索拉非尼（5、10、20 μmol/L）用藥組和不加藥的對照組。每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以（）表示。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加藥后分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h，再在每孔中加入 5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔中另加150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，最后用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm處的OD值，同時(shí)計(jì)算各組藥物對細(xì)胞增殖的抑制率，抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.3 各組細(xì)胞CDK5表達(dá)水平的檢測 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成濃度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種在蓋有玻片的6孔板中（2 mL/孔），24 h后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組中分別加入濃度為5、10、20μmol/L含索拉菲尼的培養(yǎng)液，而對照組中加不含索拉菲尼的培養(yǎng)液（2 mL/孔）。將4組細(xì)胞在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞的生長情況。拿出6孔板，分別用PBS洗滌3次（2min/次），之后用4%多聚甲醛室溫固定30 min（2 mL/孔）。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測定各組細(xì)胞CDK5的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)所有操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)弱程度反應(yīng)CDK5的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 索拉菲尼對人肝癌細(xì)胞HepG2 增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，索拉菲尼能明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長，且呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。隨著用藥時(shí)間的延長，抑制率明顯上升； 隨著用藥濃度的提高，抑制率逐漸升高，各組間兩兩比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖 1。

圖1 不同濃度索拉非尼作用不同時(shí)間對HepG2細(xì)胞的抑制作用

表1 MTT 法檢測不同濃度索拉菲尼對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（OD 值，±s）

表1 MTT 法檢測不同濃度索拉菲尼對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（OD 值，±s）

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2.2 CDK5 在人肝癌細(xì)胞株HepG2中的表達(dá)

在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組的HepG2細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生改變，較多的貼壁細(xì)胞由多形性變?yōu)橥噶恋膱A形細(xì)胞，而且懸浮細(xì)胞的比例較對照組明顯增多（圖2）。光鏡下亦觀察到CDK5陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫均質(zhì)分布，且各組細(xì)胞陽性著色顆粒的大小、分布密度及著色深淺亦有不同，隨索拉菲尼的藥物濃度增大，胞核淡染的比例增大且著色逐漸變淡（圖3）。A：對照組；B：5 μmol/L組；C：10μmol/L組；D：20μmol/L組。

圖2 倒置顯微鏡下觀察

圖3 光鏡下觀察

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段的發(fā)展過程，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到肝癌的發(fā)生發(fā)展是由一系列分子事件構(gòu)成的，比如：原癌基因和抑癌基因的平衡失調(diào)、生長因子受體的失調(diào)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常、血管生長因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶分泌的異常等[2]。而分子靶向藥物的飛速發(fā)展為治療原發(fā)性肝癌提供了新的選擇，并且新型分子靶向藥物也在臨床實(shí)踐中取得了顯著療效。原發(fā)性肝癌的分子靶向治療，主要是以腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和某些標(biāo)志性分子為靶點(diǎn)，通過選擇特異性阻斷劑對上述靶點(diǎn)和與其相關(guān)的信號通路進(jìn)行有效的干預(yù)和調(diào)控，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的效果，具有特異性強(qiáng)、療效顯著、基本不損傷正常組織等優(yōu)勢[3]。與其他惡性腫瘤一樣，肝癌中調(diào)控細(xì)胞生長的信號系統(tǒng)也處于失衡狀態(tài)，這樣其細(xì)胞則無限制生長并產(chǎn)生惡性表型。已有研究發(fā)現(xiàn)其主要信號通路有：Raf/MEK/ERK信號通路、Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子通路、P13 K/Akt/mTOR信號通路、WNT/β-連環(huán)蛋白信號通路[4]和核因子кB等。其共同機(jī)制為將細(xì)胞外異常信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過調(diào)控細(xì)胞生長、分化和周期等導(dǎo)致肝癌的形成和發(fā)展。

索拉非尼是一種新型多靶點(diǎn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，一方面通過靶向作用于Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Raf激酶來阻斷肝癌細(xì)胞的增殖；另一方面通過抑制VEGFR-2/3受體激酶活性而發(fā)揮抗血管生成效應(yīng)；亦有研究發(fā)現(xiàn)其還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[5-7]。臨床Ⅱ期及Ⅲ期實(shí)驗(yàn)已表明索拉非尼對腎癌、肝癌、黑素瘤和非小細(xì)胞肺癌都有一定的治療作用。FDA已批準(zhǔn)索拉非尼用于腎癌、肝癌的治療。索拉菲尼已被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)可以顯著延長肝癌患者的中位生存時(shí)間[8-9]。

細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白，其表達(dá)活性的改變將直接影響細(xì)胞周期的長短，這與機(jī)體細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。CDK5作為CDK家族中的一員，有60%的序列與CDK2同源， 同時(shí)也包含了全部保守的蛋白激酶區(qū)域， 并且含有該家族成員共有的PSTAIRE結(jié)構(gòu)域[12]，但與其他成員不同，CDK5既非周期素依賴，也不參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，而是與p35、p39等調(diào)節(jié)亞基相互作用在有絲分裂后神經(jīng)元復(fù)雜遷移、突觸傳遞和神經(jīng)細(xì)胞死亡等活動(dòng)中起重要作用。然而，最新研究已發(fā)現(xiàn)CDK5并不僅僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在甲狀腺髓樣癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中均有異常表達(dá)， 其主要通過影響細(xì)胞增殖及凋亡而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。董賈中等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)CDK5在肝細(xì)胞癌中也呈上調(diào)表達(dá)趨勢，且與腫瘤的分化程度相關(guān)。他們推測其原因可能為：（1）CDK5表達(dá)蛋白在肝癌細(xì)胞中發(fā)生了基因突變，導(dǎo)致CDK5蛋白結(jié)構(gòu)表達(dá)異常，從而使CDK5蛋白產(chǎn)生跨膜運(yùn)動(dòng)，最終在細(xì)胞核內(nèi)堆積；（2）CDK5作用于肝癌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子MEF-2，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄發(fā)生異常；（3） CDK5亦通過PIKE-A-Akt途徑活化Akt，進(jìn)而激活mTOR信號傳導(dǎo)通路，最終引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展；那么，如果應(yīng)用CDK5的抑制劑則可以通過減少肝癌細(xì)胞核內(nèi)CDK5/P35和磷酸化STAT3，進(jìn)而延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展?？梢?，CDK5的高表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，其可作為肝癌早期診斷的候選基因，但具體作用機(jī)制將有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：索拉菲尼作用于肝癌細(xì)胞后，其增殖受到明顯的抑制，且CDK5的表達(dá)陽性率亦顯著降低。而CDK5表達(dá)水平下降可能的原因：一方面與阻斷Raf/MEK/ERK信號通路有關(guān)，在信號轉(zhuǎn)到過程中相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生改變，干擾相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的順利進(jìn)行，使得CDK5的表達(dá)下調(diào)；另一方面索拉菲尼本身可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，存活的肝癌細(xì)胞則減少，那么CDK5的合成水平則下降，其調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用則減弱?？梢姡瑒?dòng)態(tài)觀察CDK5的水平變化可作為判斷肝癌患者病情及療效的一項(xiàng)重要的指標(biāo)。

然而，原發(fā)性肝癌細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程是一個(gè)復(fù)雜的、多種因素相互交叉的蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，若只切斷一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行治療顯然是不全面的。因此，必須尋找更多有效治療靶點(diǎn)，如通過多分子與多通路靶點(diǎn)藥物間的聯(lián)合治療、針對同一信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的接收器及其下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中任一階段的干預(yù)進(jìn)行的合并治療以及不同分子靶向藥物之間互相聯(lián)合等，有待進(jìn)一步探索。

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