張明，鄭鳳娥，楊春暉

（國(guó)家加工食品及添加劑質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，沈陽(yáng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，遼寧沈陽(yáng)110136）

在我國(guó)乳品工業(yè)中，人們廣泛采用抗生素來(lái)治療奶牛的乳腺炎和其它感染性疾病，這導(dǎo)致我國(guó)乳制品中抗生素含量較高。2001年9月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布了《無(wú)公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定生鮮乳中抗生素“不得檢出”。為了防止抗生素在乳制品中的殘留，不法生產(chǎn)者在牛奶中加入生物解抗劑，這種解抗劑就是從微生物中提取的β-內(nèi)酰胺酶。該酶能催化水解6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）及其N(xiāo)-?；苌锓肿又笑?內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵，其對(duì)青霉素具有破壞或抑制作用[1-3]。經(jīng)生物解抗劑處理過(guò)的牛奶存在以下潛在危害：①降解產(chǎn)物是抗生素的類似物，人長(zhǎng)期飲用會(huì)引起耐藥性；②解抗劑濫用會(huì)引入大量的致病菌、致癌物等有害物質(zhì)，危害人民身體健康。③產(chǎn)品以次充好，擾亂市場(chǎng)。本研究通過(guò)舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的這種作用，在樣品中先后加入舒巴坦和青霉素，采用杯碟法測(cè)定抑菌圈大小差異來(lái)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。然后對(duì)菌種、培養(yǎng)基、所選用試劑濃度和培養(yǎng)時(shí)間等方面進(jìn)行研究，確定了檢測(cè)方法條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

藤黃微球菌（Micrococcus Luteus），菌種號(hào)CMCC（B）28001，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

抗生素Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀3 g，牛肉粉3 g，瓊脂13 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～6.6。

菌種培養(yǎng)基（LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要試劑和儀器

β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥90%，酶活1 200 IU/mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所；舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品：純度89.2 %，中國(guó)藥品生物制品檢定所；青霉素G：色譜級(jí)，純度97%，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

恒溫培養(yǎng)箱（DHP9082）：上海一恒科技有限公司；抑菌圈自動(dòng)測(cè)量分析儀（ZY-300IV）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；培養(yǎng)皿：內(nèi)徑（90±0.5）mm，皿底平整光滑，厚薄均勻無(wú)凹凸現(xiàn)象；血球計(jì)數(shù)板；牛津杯：不銹鋼管，外徑[（7.8±0.1）mm]，內(nèi)徑[（6.0±0.1）mm]，高度[（10.0±0.1）mm]；陶瓦蓋：內(nèi)徑110 mm，外徑116 mm，高度26 mm。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

取新鮮培養(yǎng)的藤黃微球菌LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，每只管中加入2 mL～3 mL 滅菌生理鹽水，將菌苔洗下，振蕩均勻，合并菌液至滅菌試管中。

1.2.2 檢定用培養(yǎng)基的制備

在無(wú)菌培養(yǎng)皿中注入抗生素Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，作為底層培養(yǎng)基，水平靜置，使其凝固。將適量菌懸液加入到55 ℃左右的菌種培養(yǎng)基中，混勻，然后注入鋪有底層培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，均勻攤開(kāi)、凝固。在每個(gè)培養(yǎng)基表面放置4 個(gè)牛津杯，呈均勻?qū)ΨQ分布。檢定用培養(yǎng)基平板需當(dāng)天配置使用。

1.2.3 試樣制備

樣品：將25 mL 樣品混合均勻，待處理。陰性對(duì)照樣品：0.8%滅菌生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照樣品：酶活力為0.1 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的陽(yáng)性對(duì)照樣品。將試樣和對(duì)照品分別加入適量舒巴坦和青霉素G，將上述混合液充分振蕩混勻，室溫放置1 h。

1.2.4 試樣測(cè)定

每組試驗(yàn)做3 個(gè)重復(fù)，將陶瓦蓋蓋好，培養(yǎng)皿水平放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后去除陶瓦蓋和牛津杯，使用抑菌圈自動(dòng)測(cè)量分析儀或游標(biāo)卡尺精確測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 指示菌和菌懸液

2.1.1 指示菌的選擇

因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)是以青霉素作為直接檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行的測(cè)定，所以選擇非致病性的對(duì)青霉素敏感的藤黃微球菌作為指示菌[4]。

2.1.2 菌懸液濃度的確定

本研究使用0.8%滅菌生理鹽水3 mL 將新鮮培養(yǎng)的藤黃微球菌洗滌下來(lái)制成菌懸液[5]，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)其計(jì)數(shù)，得出菌懸液濃度為1×109cfu/mL。

2.2 培養(yǎng)基的選擇及用量

2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

下層培養(yǎng)基根據(jù)藥典采用抗生素Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，用量為10 mL。

上層培養(yǎng)基分別考察了抗生素Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基和LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂[6]按照本方法進(jìn)行操作，兩種培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出藤黃微球菌在抗生素Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基上不能良好地生長(zhǎng)，而在LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)良好，青霉素可以抑制藤黃微球菌在LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的生長(zhǎng)。因此選擇LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為上層培養(yǎng)基使用。

2.2.2 上層培養(yǎng)基的用量

為考察上層培養(yǎng)基用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們做了如下實(shí)驗(yàn)：固定下層培養(yǎng)基用量為10 mL，上層培養(yǎng)基（含1×109cfu/mL 藤黃微球菌）用量分別為4 mL、5 mL、6 mL。配制一定濃度青霉素G 的生理鹽水標(biāo)液，按照本方法進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。4 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為26.54 mm；5 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為24.16 mm；6 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為23.53 mm。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，上層培養(yǎng)基的用量越少，溶液滲透后所形成的抑菌圈越大。但考慮到雙層平板在制備的過(guò)程中對(duì)上層培養(yǎng)基溫度、培養(yǎng)基的水平程度的要求，選擇5 mL 最為適宜。

表1 上層培養(yǎng)基用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Table 1 The effects of upper medium volume on the experimental results

2.3 青霉素G 濃度的選擇

3 個(gè)抗生素檢測(cè)平板，每個(gè)平板上放置3 個(gè)牛津杯，杯中分別加入200 μL 含有0.05 μg/mL，0.1 μg/mL，0.2 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL，1.5 μg/mL，3.0 μg/mL，6.0 μg/mL，12 μg/mL 青霉素G 的10%脫脂牛奶，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度青霉素的抑菌圈實(shí)驗(yàn)Table 2 The inhibition zone test of different concentrations of penicillin

在杯碟法試驗(yàn)中，產(chǎn)生的抑菌圈越大，誤差就越大。一般選擇抑菌圈大小在24 mm 左右較為適宜。0.5 μg/mL 的青霉素G 在抗生素檢定平板上可產(chǎn)生穩(wěn)定的24 mm 的抑菌圈直徑，為了使結(jié)果更便于觀察，我們選擇0.5 μg/mL 的青霉素G 作為使用濃度。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抑菌效果的影響

2.4.1 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)藤黃微球菌生長(zhǎng)的影響

在每個(gè)抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基上均勻放置6 個(gè)牛津杯，在每個(gè)杯子中分別加入200 μL 不同濃度β-內(nèi)酰胺酶（0.001 IU/mL，0.1 IU/mL，1 IU/mL，10 IU /mL，100 IU/mL，1000 IU/mL） 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h，觀察牛津杯周?chē)囊志η闆r。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各種濃度的β-內(nèi)酰胺酶均沒(méi)有形成抑菌圈，說(shuō)明在選擇的濃度范圍內(nèi)β-內(nèi)酰胺酶對(duì)藤黃微球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

2.4.2 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素抑菌效果的影響

配制含有不同濃度單位為IU/mL 的β-內(nèi)酰胺酶（0、5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、0.05、0.5、5）的奶樣，在奶樣中加入青霉素G，使終濃度為0.5 μg/mL。

在每個(gè)抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基上均勻放置4 個(gè)牛津杯，在每個(gè)杯子中分別加入200 μL 上述樣液37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h，觀察抑菌圈情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素抑菌作用的影響Table 3 The inhibitory effects of β-lactamase on penicillin

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出濃度在0.05 IU/mL 及以上的β-內(nèi)酰胺酶可以將0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，使其失去抑菌作用。

2.5 舒巴坦用量的確定

2.5.1 舒巴坦抑菌濃度的確定

配制含有不同濃度舒巴坦（0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL）的奶樣。

在每個(gè)抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基上均勻放置4 個(gè)牛津杯，在每個(gè)杯中分別加入200 μL 以上不同舒巴坦?jié)舛鹊哪虡?7 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，以確定不產(chǎn)生抑菌圈的最高舒巴坦?jié)舛?。?shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 舒巴坦抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of sulbactam MIC

從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，舒巴坦?jié)舛仍?00 μg/mL以下均不產(chǎn)生抑菌圈，表明200 μg/mL 的舒巴坦?jié)舛仁强刂瓶股氐呐R界濃度，因此可以確定舒巴坦的安全使用濃度范圍為0～200 μg/mL。為了更安全起見(jiàn)，選取0～100 μg/mL 濃度的舒巴坦通過(guò)以下試驗(yàn)確定最佳使用濃度。

2.5.2 舒巴坦使用濃度的確定

牛奶解抗劑的推薦使用濃度為4 mL，牛奶解抗劑加入到4 t 牛奶中。本實(shí)驗(yàn)將解抗劑加到10%空白牛奶中，稀釋配成牛奶解抗劑濃度為10-4的奶樣（高于推薦使用濃度100 倍），用來(lái)確定舒巴坦的使用濃度。

2 個(gè)抗生素檢測(cè)平板，每個(gè)平板上平均放置3 個(gè)牛津杯，在2 個(gè)檢測(cè)平板的1 個(gè)牛津杯中均加200 μL含有0.5 μg/mL 青霉素的空白奶樣；其余4 個(gè)杯子杯子中分別添加200 μL 含有0.5 μg/mL 青霉素G、舒巴坦（25，50，75，100 μg/mL）的解抗劑濃度為10-4的奶樣，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。觀察產(chǎn)生抑菌圈情況，以確定舒巴坦最終適用濃度。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 確定舒巴坦使用濃度試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 5 The experimental data of the concentration of sulbactam using

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，添加舒巴坦?jié)舛葹?5 μg/mL時(shí)，抑菌圈直徑為16.99 mm，當(dāng)添加舒巴坦?jié)舛葹?0、75、100 μg/mL 時(shí)，抑 菌 圈 直 徑 分 別 達(dá) 到25.01，25.08，25.09 mm，與僅添加青霉素形成的抑菌圈直徑25.05 mm 相差很小。即當(dāng)舒巴坦的濃度為25 μg/mL未能完全抑制牛奶解抗劑的活性；舒巴坦超過(guò)50 μg/mL時(shí)，高濃度牛奶解抗劑的活性均能被抑制，因此，選擇舒巴坦的使用濃度為50 μg/mL，這一濃度與200 g/mL的舒巴坦最高安全使用濃度相差4 倍。

2.6 方法檢測(cè)限

準(zhǔn)確配置含有0.02、0.01、0.005、0.001 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的牛奶樣液，按樣品檢測(cè)進(jìn)行操作，測(cè)定牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)限，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的最低檢測(cè)限為0.005 IU/mL。

2.7 培養(yǎng)時(shí)間的確定

配制含β-內(nèi)酰胺酶0.005 IU/mL 的10%脫脂奶，做定性試驗(yàn)，共需15 個(gè)平行，在培養(yǎng)到18、20、22、24、26 h 時(shí)分別取出3 個(gè)平皿，測(cè)量A、D 圈的大小變化。結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 6 The experimental data of β-lactamase detection limit in milk

表7 β-內(nèi)酰胺酶（0.005 IU/mL）培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 7 The test data of incubation time with 0.005 IU/mL β-lactamases

由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在22 h～24 h 時(shí)，A與D 抑菌圈直徑之差趨于穩(wěn)定，所以確定培養(yǎng)時(shí)間為22 h～24 h。

2.8 方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

準(zhǔn)確配置含有0.005 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的牛奶標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用該方法進(jìn)行9 次3 組平行測(cè)定，考察方法的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表8。

表8 β-內(nèi)酰胺酶（0.005 IU/mL）檢測(cè)準(zhǔn)確度試驗(yàn)Table 8 The detection accuracy for β-lactamases（0.005 IU/mL，0.01 IU/mL）

由試驗(yàn)結(jié)果可知，0.005 IU/mL 3 組平行9 次測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好，方法準(zhǔn)確性較高。

3.9 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

配含β-內(nèi)酰胺酶0.005 IU/mL 的奶樣，配好后分裝到10 mL 離心管中，分別放在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃下保藏，分別在1、2、4、8、12 和16 d 進(jìn)行定性測(cè)定，考察不同溫度下樣品的穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

由數(shù)據(jù)可以看出，在本試驗(yàn)所選的溫度條件下（－18 ℃～－20 ℃；25 ℃；4 ℃），含0.005 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的奶樣，可以檢出β-內(nèi)酰胺酶，表明含有的β-內(nèi)酰胺酶牛奶在－18 ℃、－20 ℃、25 ℃和4 ℃的保存條件下，β-內(nèi)酰胺酶受溫度的影響較小。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸下降，但在16 d時(shí)0.005 IU/mL 依然能檢出。

表9 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 9 The stability test of β-lactamase in milk

3 結(jié)論

通過(guò)杯碟法對(duì)液體乳和乳飲料中β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，確定了杯碟法檢測(cè)液體乳和乳飲料中β-內(nèi)酰胺酶的各項(xiàng)參數(shù)。選擇藤黃微球菌作為指示菌，菌懸液濃度要求達(dá)到1×109cfu/mL，上層培養(yǎng)基使用LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂，用量為5mL，青霉素G 的使用濃度為0.5 μg/mL，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)藤黃微球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，0.05 IU/mL的β-內(nèi)酰胺酶可以將0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，舒巴坦的使用濃度為50 μg/mL。本方法中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢測(cè)限為0.005 IU/mL；最佳培養(yǎng)時(shí)間為22 h～24 h，測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性好，方法準(zhǔn)確性高。溫度試驗(yàn)證明牛奶中存在的β-內(nèi)酰胺酶在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃3 種溫度條件下，酶活力變化沒(méi)有明顯的區(qū)別。但是無(wú)論在那種溫度條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸下降，0.005 IU/mL 的β-內(nèi)酰胺酶在3 種溫度條件下16 d 依然能檢出酶活性。本方法的研究可用于監(jiān)測(cè)和檢測(cè)目前我國(guó)乳制品中使用β-內(nèi)酰胺酶的情況，為乳制品檢測(cè)提供技術(shù)支持，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的起草提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)，可用于政府部門(mén)的監(jiān)督檢驗(yàn)，也可用于企業(yè)自檢自查。

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