張秀麗，楊小明，何娟，馬海樂(lè)，田婷，孫樂(lè)六

（1.鹽城工學(xué)院博雅學(xué)院,江蘇鹽城224051；2.江蘇省生物資源加工與分離技術(shù)工程中心，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

無(wú)花果（Ficus carica L.）又名“映日果”、“奶漿果”，其果實(shí)口味香甜，日常作為鮮果、果脯和果汁食用。中醫(yī)認(rèn)為無(wú)花果味甘、性涼，具有清肺熱、止胃痛、通乳、潤(rùn)腸、消腫解毒等功效。無(wú)花果含有豐富的維生素、微量元素，是一種具有豐富營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值的水果。無(wú)花果的抗腫瘤作用已有廣泛的研究，其抗腫瘤活性成分主要為苯甲醛、補(bǔ)骨脂素、香檸檬內(nèi)酯等[1-2]，此外戴偉娟等[3-5]報(bào)道無(wú)花果多糖（Ficus carica polysaccharides,FCPS）具有免疫活性，是一種免疫功能調(diào)節(jié)劑。王振斌等[6-8]對(duì)無(wú)花果多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。吳亞林[9]對(duì)無(wú)花果粗多糖進(jìn)行純化后得到兩個(gè)單一多糖，進(jìn)行了紅外、紫外光譜分析。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)無(wú)花果多糖分子量分布、單糖組成的報(bào)道。作者在王振斌無(wú)花果多糖提取技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)考察了無(wú)花果多糖分離純化中乙醇用量和脫蛋白方法對(duì)得率的影響，完善了無(wú)花果多糖的分離純化工藝，得到精制無(wú)花果多糖，并對(duì)其理化性質(zhì)、含量、分子量范圍和單糖組成進(jìn)行了研究，為無(wú)花果多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)花果渣（榨取無(wú)花果汁后的殘?jiān)航K豐縣中研無(wú)花果責(zé)任有限公司提供；濃硫酸：上海國(guó)藥提供；考馬斯亮藍(lán)、標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖（Dextran 系列）：購(gòu)自Sigma 公司；L-鼠李糖：北京化學(xué)試劑公司。

D-木糖：上海國(guó)藥；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖：上海試劑二廠；D-阿拉伯糖Sigma 公司；無(wú)水Na2CO3、無(wú)水乙醇、碘、碘化鉀、茚三酮、α-萘酚等：購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司。以上試劑皆為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

HH 恒溫水浴鍋：江蘇中大儀器廠；GFB 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AvantiJ25 冷凍離心機(jī)：貝克曼公司；Pellicon 小型超濾系統(tǒng)：美國(guó)Millipore 公司；ALPHA2 -4 冷 凍 干 燥 機(jī)： 德 國(guó) CHRIST 公 司；CARY100Conc 紫外可見(jiàn)分光系統(tǒng)，高效液相系統(tǒng)、ProStar210 泵、ProStar 355 RI 檢測(cè)器：美國(guó)VARIAN 公司；日本TSK-GEL G4000PW（7.5×300 cm）凝膠柱、DZF-6020 型真空干燥器：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；NEXUS670 傅立葉紅外分光光度計(jì)：Nicolet 公司；氣相色譜HP5890、色譜柱HP-INNOWAX 19091N-133：美國(guó)HP 公司。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)花果多糖的分離

1.2.1.1 提取

按王振斌[6]方法提取。50 g 干燥無(wú)花果渣粉（20 目篩網(wǎng)粉碎）加入500 mL 石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）脫脂三次，待溶劑揮發(fā)后加入12 倍量蒸餾水，100 ℃，180 min 提取兩次，過(guò)濾，合并濾液。

1.2.1.2 Sevag 法脫除蛋白

濾液濃縮至原體積的1/4 后，加入Sevag 試劑（提取液∶氯仿∶正丁醇=25 ∶4 ∶1），振搖均勻后靜置分層，除去水相與有機(jī)相交界處的灰白色變性蛋白質(zhì)，水相繼續(xù)加入Sevag 試劑，重復(fù)多次。取水相分別測(cè)定蛋白和多糖含量，計(jì)算蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.1.3 乙醇沉淀

脫蛋白后的提取液在攪拌下慢慢加入一定體積的無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度分別為30%、45%、60%、75%和90%（體積比），于4℃靜置12 h，離心（3000 r/min,20 min）分離，收集沉淀，即得無(wú)花果粗多糖，計(jì)算得率?？疾煲掖加昧繉?duì)粗多糖得率的影響。

1.2.2 無(wú)花果多糖的精制

無(wú)花果粗多糖加水溶解，用截留分子量為10KD的平面纖維素超濾膜超濾（ΔP=0.1 MPa,T=25 ℃），收集分子量大于10 KDa 部分，在60 ℃以下濃縮至原體積的1/4，攪拌下慢慢加入無(wú)水乙醇至75%濃度，4 ℃靜置12 h，離心（3 000 r/min,20 min）分離，沉淀以無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，得精制無(wú)花果多糖。計(jì)算得率。

1.2.3 無(wú)花果多糖及蛋白含量的測(cè)定

總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖，苯酚-硫酸顯色后，測(cè)定A490 nm，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.808C－0.012，R=0.9991。

蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250 顯色后，測(cè)定A595 nm，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=5.779 9C＋0.010 2，R =0.999 4。式中：A 為吸光度；C 為糖/蛋白濃度，（mg/mL）。

1.2.4 無(wú)花果多糖的化學(xué)性質(zhì)驗(yàn)證

1.2.4.1 外觀及溶解性

觀察精制無(wú)花果多糖的形狀、顏色，并將其溶于水、乙醇、丙酮和乙醚，觀察其溶解性。

1.2.4.2 碘-碘化鉀反應(yīng)

取1%無(wú)花果多糖1 mL，加入碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化。

1.2.4.3 Molish 試劑反應(yīng)

取1%無(wú)花果無(wú)花果多糖1 mL 加入試管，滴家α-萘酚試劑，混勻后，傾斜試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸1 mL，豎直試管觀察濃硫酸與糖交界面顏色變化。

1.2.4.4 茚三酮反應(yīng)

取1%無(wú)花果多糖1 mL，加入0.5 mL 0.1%茚三酮乙醇溶液，混勻煮沸2 min，冷卻后觀察顏色變化。

1.2.4.5 紫外光譜檢測(cè)

將1 %的FCPS 稀釋一定倍數(shù)后，在190 nm～400 nm 范圍掃描。

1.2.4.6 紅外光譜檢測(cè)

取5 mg FCPS 凍干樣品，KBr 壓片后，在400 cm-1～40 000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.2.4.7 分子量范圍測(cè)定

將Dextran T-10、T-40、T-70 、T-500、T-2000 以水溶解后，進(jìn)樣于高效液相色譜（柱溫30 ℃，檢測(cè)器35 ℃，流動(dòng)相為娃哈哈純凈水，流速0.5 mL/min），精制無(wú)花果多糖用0.2 M NaCl 溶液配成0.5%的濃度，在相同條件下分析，推算無(wú)花果多糖的相對(duì)分子量。

1.2.5 無(wú)花果多糖單糖組成分析

1.2.5.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取精制無(wú)花果多糖10.8 mg，加入3 mL 2 mol/L 三氟乙酸,封口后于100 ℃水解8 h,水解液于40 ℃～50 ℃真空蒸干，加入10.9 mg 鹽酸羥胺、6.8 mg內(nèi)標(biāo)，0.5 mL 吡啶，封口后于90 ℃水浴30 min，冷卻后再加入0.5 mL 乙酸酐90 ℃水浴30 min，取1.0 μL 進(jìn)樣進(jìn)行GC 分析。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖處理

準(zhǔn)確稱取鼠李糖（Rha）9.5 mg, 阿拉伯糖（Ara）9.5 mg，木糖(Xyl)11.5 mg，半乳糖（Gal）9.7 mg，甘露糖（Man）10.0 mg，葡萄糖（Glu）10.6 mg，內(nèi)標(biāo)8.2 mg，加入鹽酸羥胺60.9 mg, 吡啶3 mL，封口后90 ℃水浴30 min，冷卻后再加入乙酸酐3 mL 同樣處理。

1.2.5.3 GC 分析條件

爐溫210 ℃，進(jìn)樣口250 ℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣為氮?dú)?；載氣流速0.82 mmL/min，總流量為34 mL/min；分流比40 ∶1。

由對(duì)照單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間確定單糖種類，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量和峰面積計(jì)算換算因子，推算出無(wú)花果多糖中各單糖相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)花果多糖提取液中蛋白的脫除

Sevag 法脫蛋白效果見(jiàn)圖1。

圖1 Sevag 法脫蛋白的效果及對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effects of Sevag method on protein eliminated rate and polysaccharides retainment

隨著脫除次數(shù)的增加，蛋白脫除率逐漸上升，但多糖保留率卻逐漸下降。蛋白的脫除是以損失多糖為代價(jià)，因此本試驗(yàn)中選擇脫蛋白6 次。

2.2 乙醇加入量對(duì)多糖得率的影響

乙醇加入量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果多糖得率的影響Fig.2 The effects of ethnol volume fraction on polysaccharides yield rate

試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖得率隨著乙醇濃度的上升有明顯的增加趨勢(shì)，到75%以上明顯緩慢。這與多糖分子量大小有關(guān)，大分子量多糖溶解性較差，在低濃度的乙醇中既可沉淀，而小分子多糖則要較高濃度下才能沉淀，部分單糖與寡糖不會(huì)沉淀。在試驗(yàn)中，選擇75%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行無(wú)花果多糖的沉淀。

由上述試驗(yàn)結(jié)果，無(wú)花果多糖分離純化的工藝流程為：

2.3 無(wú)花果多糖表觀性狀

經(jīng)過(guò)脫蛋白、脫除小分子雜質(zhì)后的無(wú)花果多糖為淺灰色疏松狀粉末，無(wú)味，易溶于水，其水溶液pH4.2，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。

碘-碘化鉀試驗(yàn)為陰性，Molish 反應(yīng)為陽(yáng)性，茚三酮反應(yīng)為陰性。

2.4 無(wú)花果多糖得率及總糖含量

精制無(wú)花果多糖的得率4.1%，按苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為91%。

2.5 紫外檢測(cè)

紫外掃描圖譜如圖3 顯示。

無(wú)花果多糖在192 nm 有明顯的吸收峰，表現(xiàn)為糖的特征吸收，260 nm、280 nm 處沒(méi)有蛋白質(zhì)、核酸的特征吸收。

2.6 紅外光譜

圖4 顯示無(wú)花果多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3 378、2 938、1 743、1 618、1 421 cm-1）。表現(xiàn)為378 cm-1處的O-H 伸縮振動(dòng)，2 938、1 421 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)與變角振動(dòng)；1 250～950 cm-1之間存在的吸收峰，提示糖鏈構(gòu)型為吡喃型。

2.7 分子量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖與保留時(shí)間的回歸方程為:Log Wt=9.618 8-0.324 6 Tr，R=0.994 7. 無(wú)花果多糖的分子量分布范圍在5.92×105～1.95×106之間。

2.8 單糖組成分析

無(wú)花果多糖水解液的GC 譜圖見(jiàn)圖5。

其中圖5A 為單糖標(biāo)準(zhǔn)品，按出峰時(shí)間先后順序分別為Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal 和內(nèi)標(biāo)。測(cè)定結(jié)果表明，水解液出峰的保留時(shí)分別與Rha、Ara、Xyl、Man、Glu 和Gal 準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，說(shuō)明無(wú)花果多糖中含有這6 種單糖，其摩爾質(zhì)量比值為1.93 ∶3.86 ∶0.46 ∶0.55 ∶7.42 ∶2.87。

3 結(jié)論

（1）三氯乙酸法脫蛋白常會(huì)引起多糖的降解，且制備的多糖復(fù)溶性差。故本試驗(yàn)采用Sevag 法，避免了多糖的降解，制備的多糖復(fù)溶性好。采用Sevag 法脫蛋白6 次，多糖保有率為70.2%。

（2）無(wú)花果多糖為淺灰色粉末，化學(xué)性質(zhì)驗(yàn)證為非淀粉多糖，紫外掃描說(shuō)明不含蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸，得率為4.1%，總糖含量為91%。

（3）本試驗(yàn)采用高效凝膠色譜測(cè)定出無(wú)花果多糖的分子量分布范圍在5.92×105～1.95×106之間。

（4）采用GC 法對(duì)無(wú)花果多糖進(jìn)行了單糖鑒定，是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾質(zhì)量比值為1.93 ∶3.86 ∶0.46 ∶0.55 ∶7.42 ∶2.87。

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