梁 兵,袁 芳,楊 寧,殷建瑞,蒲蜀湘,解龍昌,高慶春,高 聰△

(1.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所/神經(jīng)內(nèi)科,廣州 510260;

2.廣州醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣州 510700)

3種不同類(lèi)型基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)染類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞的效率比較*

梁 兵1,袁 芳1,楊 寧2,殷建瑞1,蒲蜀湘1,解龍昌1,高慶春1,高 聰1△

(1.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所/神經(jīng)內(nèi)科,廣州 510260;

2.廣州醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣州 510700)

目的應(yīng)用3種不同類(lèi)型基因?qū)胂到y(tǒng)攜帶能表達(dá)綠色熒光蛋白的pAAV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞株,并對(duì)細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行比較?方法 LipofectAMINE 2000?聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI,相對(duì)分子質(zhì)量為25×103)及該課題組合成的PEI-聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)4.6在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果,通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,倒置顯微鏡熒光觀察法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果?結(jié)果MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PEG-PEI 4.6的細(xì)胞存活率為83%,比PEI(70%)和 LipofectAMINE 2000(73%)的細(xì)胞存活率要高(P0.05);但 LipofectAMINE 2000和PEI的細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的檢測(cè)結(jié)果與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞類(lèi)似?倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PEG-PEI 4.6的細(xì)胞熒光表達(dá)效果比LipofectAMINE2000和PEI要好;而在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,LipofectAMINE 2000的熒光表達(dá)效果比另外兩種復(fù)合物的效果好,同時(shí)PEG-PEI 4.6的熒光表達(dá)效果比PEI要好?流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PEG-PEI 4.6的轉(zhuǎn)染效率最好,為23.2%;LipofectAMINE2000其次,為16.9%;PEI最差,為12.6%,三者兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中則是LipofectAMINE 2000的轉(zhuǎn)染效率最好,PEG-PEI 4.6其次,PEI最差,轉(zhuǎn)染效率分別為22.3%?17.2%?10.6%,三者兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?結(jié)論LipofectAMINE 2000和PEG-PEI 4.6都可作為目前神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染的傳輸載體?

神經(jīng)膠質(zhì)瘤;神經(jīng)母細(xì)胞瘤;脂質(zhì)體;轉(zhuǎn)染

目前應(yīng)用于基因治療研究的基因轉(zhuǎn)移載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi)[1]?常用的病毒載體,雖經(jīng)遺傳工程改造,去除了病原性而保留了基因轉(zhuǎn)染效能,但制備困難?目的基因插入長(zhǎng)度受限,還存在潛在的免疫反應(yīng)和生物安全等問(wèn)題?非病毒載體大多制作簡(jiǎn)單?免疫原性低?不與宿主基因整合?可重復(fù)應(yīng)用?克隆能力不受限,而其中的脂質(zhì)體和納米載體憑借其諸多優(yōu)勢(shì),成為新型非病毒載體中研究的熱點(diǎn)[2-3]?

陽(yáng)離子類(lèi)脂類(lèi)載體的研究起步較早,一些體系已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[4],這類(lèi)載體的一個(gè)主要缺點(diǎn)是在生理環(huán)境中具有尺寸多?分散性大,且易于聚集成大的顆粒而使細(xì)胞吸收效率降低;隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米陽(yáng)離子聚合物載體的穩(wěn)定性更好,結(jié)構(gòu)及性能也更容易調(diào)控,近年來(lái)成為基因傳輸研究中非常熱門(mén)的領(lǐng)域[5]?

通常培養(yǎng)的類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞和原代的神經(jīng)細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染試劑對(duì)培養(yǎng)基和血清的敏感性以及細(xì)胞毒性經(jīng)常導(dǎo)致低轉(zhuǎn)染率?低細(xì)胞低存活率和神經(jīng)退行性變化,進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)進(jìn)程受阻[6-7]?本研究比較了 LipofectAMINE 2000?聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI,相對(duì)分子質(zhì)量為25×103)及本課題組應(yīng)用過(guò)的PEI-聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)4.6在神經(jīng)系統(tǒng)常用細(xì)胞——SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果,以篩選出適合神經(jīng)系統(tǒng)常用細(xì)胞的基因治療載體,為基因技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)常用細(xì)胞中的應(yīng)用研究提供指導(dǎo)?

1 材料與方法

1.1 材料 LipofectAMINE 2000?DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;PEI購(gòu)自BASF公司;PEG購(gòu)自韓國(guó)湖南化工公司,制備成PEI-PEG 4.6?胎牛血清購(gòu)自 Hyclone公司;余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,由本實(shí)驗(yàn)室保存?用加有10% 胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng)?

1.3 質(zhì)粒DNA(pDNA)的制備 本研究應(yīng)用能表達(dá)綠色熒光蛋白的pAAV-EGFP?質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增,然后用QIAGEN試劑盒提取純化?得到的質(zhì)粒通過(guò)紫外分光計(jì)在260和280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其含量;在1.0%的瓊脂糖凝膠上以100V電壓電泳40min,檢測(cè)其完整性?檢測(cè)合格的質(zhì)粒保存于―20℃?zhèn)溆?

1.4 LipofectAMINE2000/pDNA復(fù)合物的制備 在Eppendorf管中,將1μg pDNA稀釋在50μL不含F(xiàn)BS的DMEM中,振蕩均勻,然后與2μL LipofectAMINE 2000進(jìn)行混合在室溫下振蕩5min得到均勻復(fù)合物?

1.5 PEI/pDNA和 PEI-PEG 4.6/pDNA 復(fù)合物的制備 在Eppendorf管中,將1μg pDNA稀釋在50μL不含F(xiàn)BS的DMEM中,振蕩均勻,按N/P=15把相應(yīng)量的PEI或PEIPEG 4.6加入到另外一管裝有50μL不含F(xiàn)BS的DMEM的Eppendorf管中,然后把兩溶液在室溫下振蕩5min得到均勻復(fù)合物?

1.6 細(xì)胞毒性檢測(cè)(MTT法) 兩種細(xì)胞以每孔6 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中;24h后每孔加入含有150ng pAAV-EGFP的聚合物/pDNA復(fù)合物的150μL不含血清培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每個(gè)N/P濃度復(fù)制在4個(gè)孔中,48h之后加入20μL MTT溶液(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h,小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)上層清液后,加入100μL二甲基亞砜(DMSO),室溫振蕩5min后,通過(guò)化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定在570nm處的吸光值?

1.7 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

1.7.1 轉(zhuǎn)染過(guò)程 兩種細(xì)胞以1×105細(xì)胞每孔接種在24孔板上培養(yǎng)24h,待細(xì)胞豐度70%,在轉(zhuǎn)染前4h移去培養(yǎng)基,先用等量(400μL)DMEM(無(wú)血清)培養(yǎng)基清洗,再用等量(400μL)DMEM(無(wú)血清)培養(yǎng)基替換?直接將50μL復(fù)合物加入每孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻?在37℃?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5h,更換含血清和抗生素的培養(yǎng)基,培育48h?

1.7.2 倒置熒光顯微鏡觀測(cè) 轉(zhuǎn)染48h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀測(cè)pDNA在兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果,觀察綠色熒光蛋白信號(hào),照片用Nikon熒光軟件捕獲?陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光,而陰性細(xì)胞則無(wú)?

1.7.3 流式細(xì)胞儀觀測(cè) 轉(zhuǎn)染48h后棄去上層培養(yǎng)液,細(xì)胞用500μL Hank′s平衡鹽溶液懸浮,然后應(yīng)用流式細(xì)胞儀AriaTM系統(tǒng)計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞的百分比,每種細(xì)胞重復(fù)3次取平均值?

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示,多組間兩兩比較采用方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果 所有的材料載體對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞都有一定的細(xì)胞毒性?在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PEG-PEI 4.6的細(xì)胞存活率為83%,比 PEI(70%)和LipofectAMINE 2000(73%)的細(xì)胞存活率要高(P0.05);LipofectAMINE 2000和PEI的細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的檢測(cè)結(jié)果與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞類(lèi)似?見(jiàn)圖1?

圖1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

2.2 倒置熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 為了直觀檢測(cè)各種載體的轉(zhuǎn)染效果,載體與pAAV-EGFP復(fù)合后,在兩種細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,然后分別用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)?在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞 中,PEG-PEI 4.6 的 細(xì) 胞 熒 光 表 達(dá) 效 果 比 LipofectAMINE2000和PEI要好,見(jiàn)圖2?而在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,LipofectAMINE 2000的熒光表達(dá)效果比另外兩種復(fù)合物的效果好,同時(shí)在這種細(xì)胞中PEG-PEI 4.6的熒光表達(dá)效果比PEI要好,見(jiàn)圖3?在兩種細(xì)胞中PEI的轉(zhuǎn)染效果最差,可能與其毒性最大有關(guān)?

圖2 3種基因?qū)胂到y(tǒng)在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率觀察(×100)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 為進(jìn)一步明確3種基因?qū)胂到y(tǒng)在兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率,作者利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了兩種細(xì)胞中3種基因?qū)胂到y(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PEG-PEI 4.6的轉(zhuǎn)染效率最好,為23.2%;LipofectAMINE2000其次,為16.9%;PEI最差,為12.6%,三者兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中則是LipofectAMINE 2000的轉(zhuǎn)染效率最好,PEG-PEI 4.6其次,PEI最差,效率分別為22.3%?17.2%?10.6%,三者兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?見(jiàn)圖4?

圖3 3種基因?qū)胂到y(tǒng)在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率觀察(×100)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

3 討 論

安全高效的基因傳輸載體是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵之一?非病毒載體具有易于合成和改性?無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)使其成為基因載體的一種重要類(lèi)型;但由于其具有對(duì)細(xì)胞有正電荷相關(guān)的毒性?轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低?缺乏傳輸特異性等缺點(diǎn)制約了其在臨床上的應(yīng)用[8-9]?

其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體是磷脂和其他親水親組性物質(zhì)分散于水中,由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的超微球狀載體制劑?脂質(zhì)體具有的雙重特性——親水性和疏水性,決定了脂質(zhì)體可以較好地包裹親水性物質(zhì)和親脂性物質(zhì),因此,脂質(zhì)體是目前運(yùn)用較廣泛的基因載體之一[10]?但陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高,對(duì)不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝[4]?

陽(yáng)離子納米顆粒是一種直徑在1～100nm之間的超微粒子,具有表面效應(yīng)?小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等[11]?基因轉(zhuǎn)染時(shí)將基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,在細(xì)胞攝粒作用下,納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),釋放基因治療分子,發(fā)揮其基因治療效能[12-13]?納米顆?；蜣D(zhuǎn)移載體是目前極為有效的非病毒載體,其轉(zhuǎn)染效率較傳統(tǒng)方法高百倍[14]?

基因載體的轉(zhuǎn)染效率是和納米材料或者脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性相關(guān)的,如果復(fù)合物的毒性比較高,則相應(yīng)的轉(zhuǎn)染表達(dá)水平也要下降?MTT比色法是免疫學(xué)衡量細(xì)胞增殖的經(jīng)典方法,本研究采用了 MTT實(shí)驗(yàn)研究了LipofectAMINE 2000?PEI?PEI-PEG 4.6這3種材料載體各自復(fù)合pDNA后的細(xì)胞毒性,C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞種,PEG-PEI 4.6的細(xì)胞存活率為83%,比PEI(70%)和LipofectAMINE 2000(73%)的細(xì)胞存活率要高?說(shuō)明納米材料在改造后同樣用量的時(shí)候毒性大大降低了[15]?

為了衡量轉(zhuǎn)染效果,各種材料的復(fù)合物在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別更直觀地在熒光顯微鏡下觀測(cè)以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)?在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,PEG-PEI 4.6轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白表達(dá)水平比LipofectAMINE 2000和PEI都高;而在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,LipofectAMINE 2000的綠色熒光蛋白表達(dá)水平比另外兩種載體的表達(dá)水平都高?這可能是由于細(xì)胞類(lèi)型表面表達(dá)受體不同導(dǎo)致的[7]?流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了熒光顯微鏡下觀測(cè)所得的結(jié)果?

由此可以得出,LipofectAMINE 2000和PEG-PEI 4.6都可以作為C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞基因傳輸?shù)妮d體,但由于LipofectAMINE 2000商品化程度比較高,而且表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,雖然有部分毒性作用,但仍然可作為目前神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染的傳輸載體?而PEG-PEI 4.6作為PEI的常見(jiàn)的改進(jìn)品,各方面的性能都優(yōu)于PEI,具有很高的可塑性和提升空間?

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The comparison of the transfection efficiency of three different types of gene expression system in the neurotypic cell lines*

,,,,,,,
(1./,
,,510260,;2.,,,510700,)

ObjectiveUse three different types of gene expression system carry the pAAV-EGFP plasmid can express green fluorescent protein to transfect the neurotypic cell lines and to compare their cell toxicity and their transfection effects.MethodsWe used the commercial liposomes and nanoparticles such as the LipofectAMINE 2000,the PEI(25×103)and PEG-PEI 4.6as the gene expression system,carry the pAAV-EGFP plasmid to transfect the commonly used neurotypic cells in nervous system cells such as the SH-SY5Yneuroblastoma cells and C6glioma cells.Then we detected the cell toxicity through the MTT method,and detected the transfection effects by the inverted microscope fluorescent observation and the flow cytometric method.ResultsMTT detectionResultsshowed the cell survival rate of PEG-PEI 4.6(83%)was higher than PEI(70%)and LipofectAMINE 2000(73%)in the C6glioma cells(P0.05),but the compare of the cell survival rate of PEI and LipofectAMINE 2000had no statistical significance(P0.05);The similarResultswere in the SH-SY5Yneuroblastoma cells.The inverted microscope fluorescent observed in C6glioma cells the PEG-PEI 4.6had higher fluorescence expression than LipofectAMINE2000and PEI.While in SH-SY5Yneuroblastoma cells,the LipofectAMINE2000had higher fluorescence expression than other two materials.At the same time,the PEGPEI 4.6had higher fluorescence expression than PEI.The flow cytometricResultsshowed in C6glioma cells the PEG-PEI 4.6had the best efficiency to 23.2%,LipofectAMINE2000was next of 16.9%,the worst PEI was 12.6% (P0.05);In SH-SY5Yneuroblastoma cells LipofectAMINE2000had the best efficiency,PEG-PEI 4.6second,and PEI was the worst(P0.05),the efficiency of them was 22.3% ,17.2%and 10.6%respectively.ConclusionAt present LipofectAMINE 2000and PEG-PEI 4.6can serve as the gene transfection carrier of the nervous system.

glioma;neuroblastoma;liposomes;transfection

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.003

A

1671-8348(2012)18-1792-03

* 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81100890);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(10151018201000022);廣東省博士啟動(dòng)項(xiàng)目(10451018201004383);廣州市屬高校羊城學(xué)者科研項(xiàng)目(10A010G);廣州醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金(2008c46)?△

,E-mail:smilegaocong@163.com?

2012-03-02

2012-04-22)

?臨床研究?