劉東華 (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院保健中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的首位，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導致患者無法手術(shù)徹底切除和預后差的最重要原因之一，但其發(fā)生機制仍不清楚。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C)是與腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要因子。研究表明，腫瘤患者表達的VEGF-C與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究旨在探討NSCLC患者VEGF-C蛋白的表達及內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(LYVE-1)標記的微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年6月至2009年12月本院手術(shù)治療的56例NSCLC組織作為研究對象，所有患者均經(jīng)過病理學檢測，手術(shù)前均沒有進行化療或者放射性治療。56例NSCLC患者中男39例，女17例，年齡36～74〔平均(56.25±10.48)〕歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟制訂的NSCLC TNM 分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期4例，Ⅲ期21例(包括Ⅲa期18例以及Ⅲb期3例)，Ⅳ期為2例。病理類型:鱗癌24例，腺癌29例，大細胞癌3例。所有患者進行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析，其中43例有轉(zhuǎn)移，13例未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。對照組10例均為肺良性病變，男7例，女3例;年齡32～75〔平均(51.13±8.26)〕歲;肺大皰3例，肺錯構(gòu)瘤2例，肺外傷6例。

1.2 免疫組化染色 所有患者的病變組織首先進行石蠟包埋，然后進行5 μm連續(xù)切片，再行HE以及免疫組織化學染色。VEGF-C單克隆抗體以及LYVE-1單克隆抗體(羊抗人)均購自美國R＆D，VEGF-C、LYVE-1表達水平的分析采用免疫組化試劑盒(購自北京中杉公司)。LYVE-1和VEGF-C石蠟切片分別采用檸檬酸緩沖液以及EDTA緩沖液進行高溫修復。最后用DAB顯色，蘇木精進行復染。

1.3 結(jié)果判定 免疫組織化學染色分析VEGF-C蛋白應位于腫瘤細胞及巨噬細胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。結(jié)果判定按Mattern法〔1〕:根據(jù)細胞染色強度和染色細胞所占面積積分之和來判斷。染色強度積分:不染色=0;輕度染色(淡黃色)=1;中度染色(黃色)=2;強染色(棕黃色或黃褐色)=3。染色面積積分:無細胞染色=0;＜25%細胞染色=1;25% ～50%細胞染色=2;＞50%細胞染色=3。兩種積分之和≥3分者為表達陽性;≤2表達陰性。LYVE-1蛋白主要存在于淋巴管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。LMVD計數(shù)根據(jù)Wendner的方法進行〔2〕，即:先在低倍鏡下對整個切片進行分析，尋找血管最為密集處，然后再在高倍鏡下對染色的淋巴血管進行計數(shù)，分別選取4個視野計算血管數(shù)量，然后求平均值即為LMVD。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C、LYVE-1在病變組織的表達情況 NSCLC患者病變組織中VEGF-C蛋白表達陽性者為76.79%(43/56)，明顯高于肺良性病變組織30.00%(3/10)(P＜0.05)。LYVE-1在10例良性肺病變及56例NSCLC病變組織中均呈陽性，LYVE-1陽性血管主要分布于腫瘤邊緣，在腫瘤內(nèi)部較少。LYVE-1陽性染色淋巴血管腔壁較薄，由單層內(nèi)皮細胞組成，具有毛細血管的特點;內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)中含有大量棕黃色的陽性顆粒，血管管腔內(nèi)偶爾會出現(xiàn)瘤栓，但是沒有紅細胞。NSCLC組織中MLVD(11.19±1.54)較肺良性病變組織LMVD(6.05±1.26)增多(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C表達與LYVE-1標記淋巴管密度的關(guān)系 VEGF-C表達陽性組MLVD(11.62±2.15)顯著高于LEGF-C陰性組 MLVD(9.76±1.36)(n=13，P＜0.05)。

2.3 VEGF-C表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PTNM分期的關(guān)系 NSCLC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF-C蛋白陽性率為95.45%(21/22)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF-C陽性率為67.65%(23/34)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。VEGF-C蛋白在Ⅰ期+Ⅱ期NSCLC患者中的陽性率為63.64%(21/33例)，在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC患者中的陽性率為100%(23/23)，兩組差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

淋巴管轉(zhuǎn)移是NSCLC常見且主要的擴散途徑，是影響NSCLC患者預后的重要因素。目前認為，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受體的介導和調(diào)控。VEGF-C是淋巴管內(nèi)皮生長因子，其是VEGF家族成員之一，其受體為VEGFR-3，VEGF-C與其受體結(jié)合后激活下游的信號通路進而促進淋巴管內(nèi)皮細胞大量增殖和增生;同時，VEGF-C被水解后可轉(zhuǎn)化為其成熟形式，可激活VEGF-2進一步激活血管以及淋巴管內(nèi)皮細胞。目前研究顯示，VEGF-C高表達腫瘤淋巴血管的形成以及密度，進而促進了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移，因此認為其過表達與腫瘤患者的預后關(guān)系密切〔3～5〕。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中VEGF-C的表達水平顯著高于肺良性病變組織，說明VEGF-C的過表達與NSCLC的發(fā)生以及進展有密切關(guān)系。在正常組織中，VEGF-C及其受體處于失活狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下NSCLC細胞自分泌VEGF-C，促進腫瘤淋巴管的形成，進而促進腫瘤發(fā)展。

LYVE-1是一種膜蛋白，主要分布于淋巴管內(nèi)外腔表面。目前研究顯示，LYVE-1在人和鼠正常以及腫瘤組織的淋巴血管中呈特異性表達〔6〕。汪源等〔7〕研究顯示，無論正常組織還是腫瘤組織的淋巴管內(nèi)皮細胞中LYVE-1均表達陽性。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中LYVE-1的表達水平顯著高于肺良性病變組織。VEGF-C表達陽性的組織中，MLVD顯著高于陰性組織。提示NSCLC細胞通過自分泌產(chǎn)生VEGF-C，與其受體結(jié)合激活下游信號通路促進淋巴管形成，淋巴管數(shù)目增多使癌細胞接觸淋巴管的機會增多，由于淋巴管缺乏緊密連接和連續(xù)的基底膜，腫瘤細胞易于從內(nèi)皮細胞間隙進入淋巴管，從而促進肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另一方面，VEGF-C可作為一種趨化因子活化淋巴管，誘導淋巴內(nèi)皮細胞分泌趨化因子及類似物，趨化腫瘤細胞進入淋巴管，有利于腫瘤細胞通過間質(zhì)液的流動被動轉(zhuǎn)運到淋巴管，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。VEGF-C表達增高、淋巴管密度增加是促使NSCLC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要原因。本研究結(jié)果提示VEGF-C過表達促進了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預后不，與腫瘤的惡性程度明顯相關(guān)。通過抑制腫瘤細胞自分泌VEGF-C或者阻斷VEGF-C以及下游的信號通道，可抑制腫瘤淋巴血管的形成，并降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，對患者的預后有著重要意義。

1 Mattern J，Koommagl R，Voim M.Biological characterization of subgroups of squamous cell lung carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，1999;5(6):1459-63.

2 鄭亞民，達明緒，趙紫罡，等.胃癌癌周微淋巴管密度與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究〔J〕.華西醫(yī)學，2006;21(2):269-71.

3 Hirakawa S，Brown LF，Kodama S，et al.VEGF-C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites〔J〕.Blood，2007;109(3):1010-7.

4 Karkkainen MJ，Haiko P，Sainio K，et al.Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins〔J〕.Nat Immunol，2004;5(1):74-80.

5 Yonemura Y，Endo Y，Tabata K，et al.Role of VEGF-C and VEGF-D in lymphangiogenesis in gastric cancer〔J〕.Int J Clin Oncol，2005;10(5):318-27.

6 Vainionpaa N，Biitzow R，Hukkanen M，et al.Basement membrane protein distribution in LYVE-1 immunorcactive lymphatic vessels of normaltissues and ovarian carcinomas〔J〕.Cell Tissue Res，2007;328(2):317-28.

7 汪 源，潘鐵成，陳 濤.非細胞肺癌(NSCLC)的LYVE-1陽性微淋巴管密度與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009;17(7):1243-5.