陳思呈，劉金磊，盧鳳來(lái)，李典鵬*

(1.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林541006;2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

番茄Lycopersicon esculentum Mill.為茄科番茄屬植物，原產(chǎn)南美洲，我國(guó)各地均普遍栽培。番茄皂苷為番茄中水溶性成分，而番茄紅素為番茄中脂溶性成分，在加工生產(chǎn)番茄紅素過(guò)程中，往往需要脫水而將番茄皂苷白白損失浪費(fèi)掉。目前國(guó)內(nèi)還很少有番茄皂苷的研究報(bào)道，日本的研究人員在番茄皂苷的理化性質(zhì)及藥理活性方面進(jìn)行了深入而廣泛的研究，并證明番茄皂苷尤其是主要成分番茄皂苷A(esculeoside A)具有多種生理和藥理活性，其在降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化方面具有獨(dú)特的作用［1-2］。

目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)番茄皂苷提取工藝的研究報(bào)道。選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧?，破壞?xì)胞壁的致密構(gòu)造，有利于有效成分的溶出，以提高目標(biāo)物質(zhì)的得率［3］。果膠酶(pectinase)是能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱［4］，果膠酶作用于果膠質(zhì)中D-半乳糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，使高分子的聚半乳糖醛酸降為小分子物質(zhì)［5］。本實(shí)驗(yàn)首次建立了番茄總皂苷果膠酶酶解的工藝，為進(jìn)一步研究番茄皂苷提供了依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司);安捷倫化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司);R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司);TL-5.0臺(tái)式離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所);TP-2200B電子天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司);METTLER AT200分析天平(上海涵今儀器儀表有限公司);B3500S-MT超聲清洗器(必能信超聲有限公司);L-550離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);Christ Alpha 1-2實(shí)驗(yàn)室高級(jí)凍干機(jī)(德國(guó)Martin Christ公司);MILLIPORE Simplicity超純水器(上海人和科學(xué)儀器有限公司);果汁機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料新鮮成熟櫻桃小番茄，購(gòu)自桂林資源縣番茄種植基地;自制番茄皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)核磁共振譜1HNMR，13C-NMR鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC-ELSD法測(cè)定得出純度為98.9%)。

1.3 化學(xué)試劑果膠酶(型號(hào):PP-3，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司);甲醇(美國(guó)TEDIA公司，色譜純);重蒸蒸餾水(自制);超純水(自制);去離子水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 番茄皂苷A的測(cè)定番茄皂苷A在HPLC-ELSD檢測(cè)法中顯示其相對(duì)含有量占總皂苷的很大的部分，其它皂苷類物質(zhì)則含有量很低［6］，因此后續(xù)大部分工藝環(huán)節(jié)主要以番茄皂苷A為考察指標(biāo)。同一批次番茄打漿酶解后直接通過(guò)測(cè)定番茄皂苷A的濃度來(lái)評(píng)價(jià)工藝參數(shù)，可以減少過(guò)多的后續(xù)操作帶來(lái)計(jì)算結(jié)果上的誤差。番茄中的皂苷主要為甾體皂苷，而由于甾體皂苷具有無(wú)紫外吸收或吸收極弱的特點(diǎn)，其檢測(cè)存在很大的困難［7］，目前據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的、蒸發(fā)光散射檢測(cè)已經(jīng)成功地應(yīng)用于酸棗仁皂苷、人參皂苷、黃芪皂苷等的定量分析與檢測(cè)［8］。因此對(duì)其測(cè)定方法及條件進(jìn)行了研究。

2.1.1 番茄皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品的配制精密稱取10.00 mg番茄皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇水溶液(在此濃度的溶劑中有最好的溶解度)定容到50 mL，配置成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，即0.2 μg/μL的番茄皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 色譜條件的確立色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:甲醇-水(梯度洗脫:0→5 min:20%→40%甲醇;5→10 min:40%→60%甲醇;10→20 min:60%→80%甲醇);檢測(cè)時(shí)間:20 min;后運(yùn)行時(shí)間:5min;流動(dòng)相體積流量:0.8 mL/min;ELSD檢測(cè)器參數(shù):漂移管溫度:100℃?？諝?2.7L/min。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC色譜圖

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備依次精密吸取0.6、1.2、1.8、2.4、3.6、4.2 μg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積積分值的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。回歸方程為:Y=1.697 4X+5.717 3，R2=0.999 6。番茄皂苷A在0.6～4.2 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次15 μL，記錄峰面積，計(jì)算峰面積及相當(dāng)于番茄皂苷A質(zhì)量的RSD值，其中峰面積RSD為1.01%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為0.61%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密稱取粗皂苷粉末102.00 mg，定容至50 mL，0～10 h分別檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算峰面積及質(zhì)量的RSD值。其中峰面積RSD為2.95%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為1.73%，結(jié)果表明，供試樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取6份粗皂苷粉末，每份100 mg，定容至50 mL，檢測(cè)并記錄峰面積，計(jì)算峰面積及質(zhì)量的RSD值。其中峰面積RSD為2.17%，番茄皂苷A質(zhì)量RSD為1.31%，結(jié)果表明，供試樣品重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取4份測(cè)定過(guò)番茄皂苷A含有量的粗皂苷粉末，每份約100 mg。精密稱取番茄皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品4份，每份2 mg，分別加到4份樣品中，最后定容到50 mL。檢測(cè)峰面積，求算回收率、平均回收率和RSD值。平均回收率為96.03%，RSD為0.41%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，符合測(cè)定要求。

2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱量9份，每份1 kg，放入燒杯中，分別加入相當(dāng)于鮮果質(zhì)量0.0、0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、0.6‰、0.7‰、0.8‰的果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2.0 h，立即取出離心，液相檢測(cè)其中番茄皂苷A的峰面積，計(jì)算其質(zhì)量濃度，平行2份，結(jié)果取平均值。由圖2可知，隨著添加酶量的增加，開(kāi)始時(shí)清液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度逐漸升高，超過(guò)0.5‰后逐漸下降。有文獻(xiàn)報(bào)道果膠酶制取總皂苷相關(guān)工藝，分析其中的原因可能是，當(dāng)繼續(xù)加大酶量，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制，造成皂苷得率下降［9-10］，孟碩等實(shí)驗(yàn)證明單一果膠酶對(duì)苷鍵亦有一定的水解作用［11］。實(shí)驗(yàn)用的果膠酶，其中可能存在一些競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子，則會(huì)抑制果膠酶與底物的結(jié)合，雜質(zhì)糖苷酶的存在也會(huì)造成皂苷類物質(zhì)糖苷鍵的水解。但是一定量果膠酶的加入，增加了番茄漿的澄清度和可過(guò)濾性，使得后續(xù)的離心及過(guò)柱更簡(jiǎn)便易行［12］，因此選定最佳酶加入量為0.4‰。

圖2 酶添加量對(duì)番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.2 酶解反應(yīng)溫度對(duì)酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在35、40、45、50、55、60、65℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測(cè)上清液中番茄皂苷A峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量濃度。由圖3可知，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50℃時(shí)，番茄皂苷A的質(zhì)量濃度達(dá)到最高。

圖3 酶解溫度對(duì)番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.3 酶解反應(yīng)pH值對(duì)酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，pH值分別調(diào)到2.5、3.0、3.75(番茄汁自身pH值)、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0(調(diào)到7.0時(shí)顏色突然變深)。加入0.4‰果膠酶，在50℃條件下恒溫酶解2 h，離心，檢測(cè)上清液中番茄皂苷A峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量濃度。由圖4可知，當(dāng)酶解pH值為3.75～5.0時(shí)，酶解液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度最大。

圖4 酶解pH值對(duì)番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.2.4 酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解效果的影響將番茄打成勻漿，精密稱取7份，每份1 kg，放入燒杯中，加入0.4‰果膠酶，在50℃，pH4.0下，分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，每份酶解液取出后，立即離心，檢測(cè)上清液中番茄皂苷A峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量濃度。由圖5可知，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，酶解液中番茄皂苷A質(zhì)量濃度達(dá)到最大。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)番茄皂苷A質(zhì)量濃度影響

2.3 番茄酶解正交實(shí)驗(yàn)考慮到以上酶解單因素對(duì)番茄皂苷A提取效果均有不同程度的影響，并且4個(gè)單因素之間存在著交互的作用。因此，選取這4個(gè)單因素，在3個(gè)不同水平上，按照L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 正交因素與水平的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2，表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 方差分析

由極差分析及方差分析可知，酶解法制得番茄清液中，番茄皂苷A質(zhì)量濃度或得率的影響因素主次順序?yàn)?C＞D＞A＞B，即影響酶解法中番茄皂苷A質(zhì)量濃度的因素依次是:酶用量＞酶解pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。其中在所選定的3個(gè)水平下，酶添加量對(duì)番茄皂苷A的質(zhì)量濃度影響比較顯著。

因此確定酶解法最佳提取條件為:A3B2C2D2，即最佳提取工藝為:酶解溫度55℃，酶解時(shí)間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。

2.4 酶解工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批次西紅柿6份，每份45 kg，分為加酶組和不加酶組，每組3份，加酶組機(jī)器打漿后按優(yōu)選出的最佳工藝條件進(jìn)行酶解，并經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附制取總皂苷。另一組不加酶，機(jī)器打漿后直接離心過(guò)大孔柱吸附制取總皂苷。結(jié)果見(jiàn)表4，加酶組所得總皂苷平均得率為0.25%，明顯高于不加酶組的0.14%。并且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不加酶組所得番茄汁含有大量絮狀細(xì)胞團(tuán)，給離心及過(guò)柱帶來(lái)了極大困難。此外，由于番茄水分經(jīng)冷凍干燥法測(cè)定高達(dá)90%以上，在大生產(chǎn)中若采用溶劑提取法則很難實(shí)現(xiàn)，綜合考慮成本及可操作性，果膠酶法明顯優(yōu)于其他提取法。

表4 不同提取法總皂苷得率比較

3 分析與討論

3.1 番茄果實(shí)含水量高，經(jīng)測(cè)定在90%以上，若采用溶劑提取法則操作困難，成本必將很高。為使工藝過(guò)程更為高效而低成本，首先采用機(jī)械破碎的方式使大量細(xì)胞破壁促進(jìn)內(nèi)含物充分釋放。機(jī)械破碎后得到的番茄漿黏度大，且存在大量未被充分破碎的細(xì)胞。為了使番茄細(xì)胞充分破碎及分離以提高番茄皂苷的得率及后續(xù)的過(guò)柱性能，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用果膠酶法并優(yōu)化其條件，實(shí)驗(yàn)證明酶解工藝是高效可行的。

3.2 通過(guò)對(duì)影響酶解效率的4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在單因素的基礎(chǔ)上對(duì)這4個(gè)單因素在3個(gè)水平上，按照L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)平行2份，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析及方差分析，得出最佳酶解工藝條件為:酶解溫度55℃，酶解時(shí)間2 h，酶添加量0.4‰，pH4.0。其中在所選定的3個(gè)水平下，酶添加量對(duì)番茄皂苷A的質(zhì)量濃度影響比較顯著，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)果膠酶的用量要嚴(yán)格控制。

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