尹登科，楊曄，尹娟娟，韓嵐，許釩，彭代銀

(安徽中醫(yī)學院藥學院安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥230031)

桃紅四物湯出自清·吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒》，由熟地、當歸、白芍、川芎、桃仁、紅花組成，是活血化瘀的代表方、基礎方，主治血瘀之證。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯醇提物對血瘀證大鼠模型表現(xiàn)出較好的活血化瘀作用［1］，對正常大鼠經(jīng)二磷酸腺苷(ADP)和腎上腺素(Adr)誘導的血小板活化具有顯著的抑制作用［2］。血小板可以通過多種信號途徑被激活，但是凝血酶是最強的內(nèi)源性血小板激動劑，凝血酶主要通過血小板表面的蛋白酶激活受體(proteinase activated receptors，PARs)活化血小板，人血小板表達PAR1和PAR4，PAR1或PAR4可通過不同的信號途徑激活血小板，所產(chǎn)生的生理效應也不同。PAR1激活可促進血小板釋放促血管生成因子，而PAR4激活誘導血管生成抑制因子的釋放［3］。血小板活化對內(nèi)皮細胞功能的影響是導致血瘀證的重要方面［4］，前期研究表明桃紅四物湯含藥血清具有促進內(nèi)皮細胞增殖的作用［5］，本實驗體外考察桃紅四物湯對PAR1和PAR4誘導血小板聚集以及釋放VEGF和endostatin的作用，為進一步闡明桃紅四物湯治療血瘀證打下基礎。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑熟地黃、白芍、當歸、川芎、桃仁、紅花購自安徽安保藥業(yè)有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)學院中藥與資源教研室鑒定。健康無菌臍帶由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。凝血酶(10 U/mg，Ruibio)，PAR1-AP(SFLLRN-NH2)和PAR4(AYPGKF-NH2)由上海強耀生物科技有限公司合成，純度＞98%;人血管內(nèi)皮生長因子ELISA試劑盒、人內(nèi)皮抑素ELISA試劑盒，購自合肥博美生物技術公司;M199培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

1.2 桃紅四物湯醇提物的制備將熟地黃4 g，白芍3 g、當歸3 g、川芎2 g、桃仁3 g、紅花2 g加入10倍量(V/W)75%乙醇(V/V)回流提取2 h，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)至干，加入DMSO溶解，然后在15 000×g離心15 min，取上清(1 mL相當于原藥材2.5 g)，－20℃保存。使用前用生理鹽水稀釋至1 mL相當用于原藥材25 mg。

1.3 富血小板血漿的制備取近兩周未服用阿司匹林或其非甾體抗炎藥物健康人血20 mL，和3.8%枸櫞酸鈉(8∶1 V/V)混合均勻。室溫條件下200×g離心20 min，小心吸取上清即得富血小板血漿(PRP)。取部分富血小板血漿在400×g離心15 min，取上清為貧血小板血漿(PPP)，用貧血小板血漿調(diào)富血小板血漿至2.5×108mL－1。

1.4 血小板聚集實驗取0.4 mL富血小板血漿(2.5×108mL－1)，加入不同體積的桃紅四物湯(8、20、40 μL)至終質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL，同時設置0.1%(V/V)DMSO對照，37℃，500 r/min孵育5 min，再加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)，以貧血小板血漿調(diào)零，記錄5 min內(nèi)吸光值變化情況。

1.5 血小板釋放VEGF和Endostatin取0.4 mL富血小板血漿(2.5×108mL－1)，加入桃紅四物湯至終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，同時設置0.1%DMSO對照，37℃，500 r/min孵育5 min，再加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)孵育5 min，10 000 r/min，4℃離心15 min，上清－20℃保存，ELISA法測定VEGF和Endostatin。

1.6 血小板分泌液的制備取5 mL富血小板血漿與桃紅四物湯(2.5 mg/mL)或?qū)φ?.1%DMSO 37℃，500 r/min振蕩孵育5 min，每組平均分成4份，分別加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)或空白(生理鹽水)，使終體積相等，37℃孵育5 min;10 000 r/min，4℃離心15 min，上清立即用于內(nèi)皮細胞增殖實驗。

1.7 血小板釋放液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)采用文獻報道的方法在體外分離培養(yǎng)［6］，HUVECs經(jīng)胰酶消化，收集細胞接種于含有1%明膠包被的96孔板中，細胞數(shù)為2×104個/mL，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，換1%FBS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，小心移去培養(yǎng)基，加入含1%FBS的M199培養(yǎng)基180 μL和血小板分泌液20 μL，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，振蕩10 min后，酶標儀測定490 nm的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯對PAR1-AP和PAR4-AP誘導血小板聚集的作用PAR1-AP(10 μmol/L)和PAR4-AP(200 μmol/L)均可以顯著的誘導人血小板聚集，其中PAR1-AP可誘導血小板最大聚集率達到82%±8.3%，桃紅四物湯(0.5～2.5 mg/mL)可劑量依賴性的抑制PAR1-AP和凝血酶誘導的血小板聚集。但是對PAR4-AP誘導的血小板聚集沒有顯著的抑制作用(表1)。這些結(jié)果表明桃紅四物湯可選擇性的抑制PAR1-AP誘導的血小板聚集。

表1 對PAR1-AP和PAR4-AP誘導血小板聚集的抑制作用±s，n=4)Tab.1 Effect of Taohong Siwu Decootion on PAR1-AP and PAR4-AP induced platelet aggregation ±s，n=4)

表1 對PAR1-AP和PAR4-AP誘導血小板聚集的抑制作用±s，n=4)Tab.1 Effect of Taohong Siwu Decootion on PAR1-AP and PAR4-AP induced platelet aggregation ±s，n=4)

注:同0.1%DMSO組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別質(zhì)量濃度/(mg·mL－1)聚集率%PAR1-AP/(10 μmol·L－1)PAR4-AP/(200 μmol·L－1)Thrombin/(1 U·mL－1)0.1%DMSO82.4±8.375.2±5.878.4±6.7桃紅四物湯0.577.1±6.973.6±4.973.1±7.5桃紅四物湯1.2558.6±7.2*72.2±5.259.9±6.2*桃紅四物湯2.521.5±6.3＊＊69.7±6.932.3±5.8＊＊

2.2 桃紅四物湯對PAR1-AP，PAR4-AP和凝血酶誘導血小板釋放VEGF和Endostatin的影響凝血酶(1 U/mL)對人血小板分泌VEGF和endostatin沒有顯著影響，但是PAR1-AP(10 μmol/L)可誘導血小板VGEF釋放，PAR4-AP(200 μmol/L)可誘導血小板endostatin。桃紅四物湯在2.5 mg/mL可顯著抑制PAR1-AP誘導的VEGF和PAR4-AP誘導的endostatin分泌，盡管桃紅四物湯可以抑制VEGF分泌，但血小板分泌VEGF仍顯著高于對照組(0.1%DMSO)。見圖1。

圖1 桃紅四物湯對PAR1激動劑，PAR4激動劑和凝血酶誘導血小板釋放VEGF和Endostatin的影響(±s，n=3)Fig.1 Effect of Taohong Siwu Decoction on VEGF and endostatin releasing by PAR1-AP，PAR4-AP or thrombin activated platelets±s，n=3)

2.3 PAR1-AP，PAR4-AP和凝血酶誘導的血小板釋放液對HUVECs增殖的影響及桃紅四物湯的作用富血小板血漿經(jīng)凝血酶(1 U/mL)，PAR1-AP作用后的釋放液可顯著誘導HUVECs增殖，但是經(jīng)PAR4-AP作用后的釋放液抑制HUVECs增殖;富血小板血漿經(jīng)桃紅四物湯(2.5 mg/mL)預處理后，可顯著抑制PAR1-AP組的細胞增殖以及促進PAR4-AP組的細胞增殖;但是對凝血酶組沒有顯著作用，見圖2。

圖2 PAR1激動劑，PAR4激動劑和凝血酶誘導的血小板釋放液對用HUVECs增殖的影響及桃紅四物湯的作用±s，n=6)Fig.2 Influence of Taohong Siwu Decoction on HUVECs proliferation affected by secretions of activated platelets by PAR1-AP，PAR4-AP or thrombin HUVECs proliferation±s，n=6)

3 討論

桃紅四物湯是治療血瘀證的經(jīng)典名方，對于婦女月經(jīng)不調(diào)，心腦血管疾病都有廣泛的治療作用［7］。中醫(yī)理論對活血化瘀證治療的根本理念之一是在活血祛瘀基礎上，祛瘀生新、活血生脈，其重要的一個方面是對內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)作用。血小板的黏附性、聚集性增強，功能亢進是反映血瘀證的客觀性指標之一。血小板活化參與了血瘀證的發(fā)生與發(fā)展，是血瘀證產(chǎn)生的重要病理生理基礎。血小板除了參與血瘀的形成過程，它同樣具有調(diào)節(jié)血管形成的作用，血小板來源的VEGF和bFGF在血小板促進內(nèi)皮細胞增殖中起重要作用，其關鍵的過程是通過血小板膜受體途徑釋放促血管生成因子(VEGF、EGF、bEGF、PDGF等)和血管生成抑制因子(endostatin、PF-4、thrombospondin-1、α-macroglobulin、plasminogen active inhibitor-1等)。這些血管生成促進因子與抑制因子分別儲存在不同的α顆粒中，當用PAR1-AP激活血小板時，釋放促血管生成因子，而用PAR4-AP激活血小板，釋放血管生成抑制因子［3］。凝血酶是PAR1和PAR4的激動劑，在激活血小板聚集的同時釋放血管生成促進因子和抑制因子。由血小板釋放的血管生成相關因子調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化，對活血化瘀作用具有重要的調(diào)節(jié)作用。

PAR1和PAR4是凝血酶作用于人血小板的受體，盡管PAR1和PAR4都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，但是對凝血酶的親和力以及誘導血小板的活化的途徑不同［8-11］，其不同的激活狀態(tài)可能是導致血瘀證的重要因素之一。本實驗在體外考察了桃紅四物湯對凝血酶及PAR1-AP和PAR4-AP誘導血小板聚集的作用，桃紅四物湯可顯著抑制凝血酶和PAR1-AP誘導的血小板聚集，而對PAR4-AP誘導的血小板聚集沒有顯著的抑制作用。由于凝血酶是血小板最強的激動劑，所以針對其受體的抑制劑是治療心腦血管疾病重要途徑。凝血酶激活PAR1可通過Gα12/13，Gα，和Gαi/z及細胞內(nèi)信號途徑導致血小板發(fā)生一系列功能改變，如TXA2合成，ADP釋放，整合蛋白的表達及血小板聚集。PAR1激活也使得血小板處于超敏狀態(tài)，如血栓和纖維蛋白生成增加。PAR4主要通過激活Gαq和Gα12/13途徑激活血小板，和PAR1不同的是，PAR4不激活Gαi途徑［12］。盡管蛋白酶激活受體途徑及功能還沒有完全闡明，但是PAR1選擇性抑制劑相當于凝血酶抑制劑具有更強的優(yōu)勢，因為選擇性抑制PAR1激活的血小板導致出血的風險大大降低［13］。

由于血小板釋放血管生成相關因子對內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)作用，所以研究桃紅四物湯對血小板不同狀態(tài)下血管生成相關因子的表達非常必要。富血小板血漿經(jīng)凝血酶和PAR激動劑誘導后釋放VEGF和endostatin的量存在顯著差異，凝血酶在1 U/mL濃度時對人血小板釋放VEGF和endostatin沒有顯著變化，但是PAR1-AP(10 μmol/L)可顯著增加VEGF釋放，而PAR4-AP(200 μmol/L)可顯著增加endostatin的釋放，這與前期報道結(jié)果一致［14］;當血小板與桃紅四物湯(2.5 mg/mL)預處理后，可顯著抑制PAR1-AP誘導的VEGF釋放以及PAR4-AP誘導的endostatin的釋放，盡管抑制VEGF釋放，當其含量仍高于未激活的血小板。進一步采用HUVECs增殖實驗，發(fā)現(xiàn)凝血酶和PAR1-AP作用后的血小板釋放液能刺激HUVECs增殖，PAR4-AP作用后的血小板釋放液抑制HUVECs增殖。血小板與桃紅四物湯(2.5 mg/mL)預處理后，可顯著抑制PAR1-AP組的細胞增殖，同樣也可以部分解除PAR4-AP組對HUVECs增殖的抑制作用，但是對凝血酶組引起的細胞增殖沒有顯著抑制作用。這可能是由于凝血酶同時激活釋放多種內(nèi)皮細胞生長調(diào)節(jié)因子造成。

本實驗在體外考察了桃紅四物湯對蛋白酶激活受體激活引起血小板聚集以及VEGF和endostatin釋放的影響，結(jié)果表明，桃紅四物湯可選擇性抑制PAR1-AP引起的血小板聚集，說明桃紅四物湯對凝血酶誘導的血小板聚集的抑制作用主要通過受體PAR1介導的信號途徑。而血小板不同活化狀態(tài)對VEGF和endostatin釋放以及內(nèi)皮細胞增殖的實驗結(jié)果表明，桃紅四物湯既可以抑制PAR1-AP活化血小板誘導內(nèi)皮細胞增殖，同時又可以減少PAR4-AP活化血小板對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用，表現(xiàn)出穩(wěn)定血小板的作用，這和血小板釋放液中VEGF和endostatin有相關性。桃紅四物湯對蛋白酶激活受體激活引起血小板聚集及VEGF和endostatin釋放的作用，可能是桃紅四物湯發(fā)揮活血化瘀作用的機制之一。

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