姚麗梅，黃海定，朱偉*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州5105202.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州510006)

中西藥聯(lián)用，在我國許多醫(yī)院已成臨床用藥的常規(guī)。有研究顯示:一些中藥和西藥合用會產(chǎn)生相互作用，因此，為了公眾的安全，有必要深入研究中西藥間相互作用［1-2］。氯吡格雷作為一種新型抗血小板藥物，已成為冠心病抗血小板藥物治療的基石［3］，復(fù)方丹參滴丸是丹參、三七及冰片組成的純中藥滴丸劑，目前已經(jīng)在全國多家醫(yī)院廣泛用于多種心血管疾?。?-5］，因此這兩種藥物在臨床合并使用的情況比較普遍，但兩者是否存在相互作用、會不會影響臨床療效尚無專門的研究。本研究采用高血脂小鼠模型，觀察復(fù)方丹參滴丸對硫酸氫氯吡格雷抗血小板功能的影響，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥有限公司，批號:110317)，硫酸氫氯吡格雷(賽諾非安萬特(杭州)制藥有限公司，批號:2613)。

1.2 動物SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號為0086042。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院動物實驗中心SPF級環(huán)境中，在恒溫(20±24)℃、恒相對濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng)，環(huán)境設(shè)施許可證號:SYXK(粵)2008-0094。

1.3 試劑膽固醇、膽酸鈉購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司(批號:20110412);抗小鼠單克隆熒光標記抗體:CD41-PE-CY7，CD14-FITC，CD62P-PE;同型對照:Rat IgG1κ-PE-CY7，Rat IgG2aκ-FITC，Rat IgG1κ-PE等試劑均購自美國eBioscience公司;1%多聚甲醛、PBS緩沖液購自廣州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;溶血素C購自美國貝克曼庫爾特公司;血脂測定試劑盒購自寧波美康生物科技有限公司(批號:20110412)。

1.4 儀器FC—500流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);Trilogy全自動血液生化分析儀(英國DREW公司)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及給藥先以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將小鼠隨機分為5組，每組10只，基礎(chǔ)飼料組(NCG)喂飼基礎(chǔ)飼料;高脂飼料組(HCG)喂飼高脂飼料(高脂飼料配方如下:2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉、10%動物油、82.5%標準飼料，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心加工制成);高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組、高脂飼料+聯(lián)合用藥組。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，各藥物治療組在造模第8周開始灌胃給藥，連續(xù)給藥2周。氯吡格雷的給藥量為21 mg/(kg·d)，復(fù)方丹參滴丸的給藥量為160 mg(生藥)/(kg·d)。小鼠自由攝食和飲水，每周稱量體質(zhì)量1次，按體質(zhì)量換算藥物的灌胃量，正常對照組灌服同體積蒸餾水。

1.5.2 血脂指標測定飼養(yǎng)結(jié)束后，停止喂食24 h，摘眼球取小鼠血，常規(guī)分離血清，以血脂試劑盒在全自動生化分析儀上測定小鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5.3 血小板活化檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC和CD62P-PE抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血5 μL，避光孵育15～20 min，加入1 mL預(yù)冷(2～8℃)的1%多聚甲醛，2～4℃避光20 min，24 h內(nèi)上機檢測。

1.5.4 單核細胞血小板聚集和中性粒細胞血小板聚集檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血50 μL，避光孵育15～20 min，加入溶血素C 500 μL，震蕩混勻，靜置待溶液透明，加入1 mL PBS混勻，上機檢測。用SS和CD14射門，分別收集單核細胞和中性粒細胞細胞5 000個，分別計算單核細胞和中性粒細胞細胞上CD41的表達百分率，分別表示單核細胞血小板聚集率和中性粒細胞血小板聚集率。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平的情況與基礎(chǔ)飼料組相比，高血脂癥4組小鼠的體質(zhì)量均明顯增加(P＜0.05)，見圖1。表1的數(shù)據(jù)顯示，高脂飼料組組小鼠血脂TC、TG和LDL-C均明顯高于基礎(chǔ)飼料組，各組HDL-C水平無顯著性差異，說明本實驗高血脂癥小鼠模型的建立是成功的。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較Fig.1 Comparison of mice weight in different groups

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

注:與基礎(chǔ)飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)基礎(chǔ)飼料組1.04±0.08 2.31±0.291.00±0.070.29±0.051.01±0.08高脂飼料組4.19±0.31＊＊1.33±0.10﹡0.52±0.09＊＊1.05±0.10高脂飼料+氯吡格雷組3.50±0.57＊＊△1.23±0.22﹡0.41±0.06＊＊△◇◇1.02±0.08高脂、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組3.87±0.47＊＊1.30±0.12＊＊0.52±0.07＊＊1.00±0.08高脂飼料+聯(lián)合用藥組3.01±0.64＊△△◇◇1.12±0.13＊＊△△◇◇0.37±0.06＊＊△△◇◇

2.2 各組小鼠血小板功能的比較圖2和表2數(shù)據(jù)表明，與基礎(chǔ)飼料組比較，高脂飼料組的活化血小板比例、單核細胞血小板聚集率和中性粒細胞血小板聚集率都有顯著性增加(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的單核細胞血小板聚集率有顯著性增加(P＜0.01或P＜0.05)。與高脂飼料組相比，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的活化血小板比例有顯著性降低(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的中性粒細胞細胞血小板聚集率也有顯著性降低(P＜0.01或P＜0.05)，但高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的單核細胞血小板聚集率的差異無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 流式細胞儀分析活化血小板(A)、單核細胞血小板聚集(B)和中性粒細胞血小板聚集(C)的散點圖Fig.2 Scatter plot of activated platelets(A)，monocyte-platelet aggregation(B)and neutrophilplatelet aggregation(C)by flow cytometry

表2 不同組別小鼠血小板表達比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

表2 不同組別小鼠血小板表達比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

注:與基礎(chǔ)飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+聯(lián)合用藥組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別活化血小板/%單核細胞血小板聚集率/%中性粒細胞細胞血小板聚集率/%28.02±5.867.24±2.6319.87±4.34高脂飼料組45.75±6.94＊＊13.55±3.93＊＊32.77±5.95＊＊高脂飼料+氯吡格雷組32.48±4.74＊△△◇◇11.46±2.33＊＊24.74±4.67△◇高脂、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組32.62±5.90△△◇◇10.69±2.64*23.00±4.62△△◇高脂飼料+聯(lián)合用藥組20.15±3.78＊△△11.16±1.82*19.37±3.13基礎(chǔ)飼料組△△

3 討論

血小板極易激惹活化，樣本經(jīng)離心、洗滌等步驟，容易人為地導(dǎo)致體外血小板激活，影響檢測價值。本研究采用的全血法流式細胞術(shù)盡可能避免血小板體外醫(yī)源性激活，防止血小板亞群丟失，在檢測過程中不會受其它種類細胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性。本研究檢測指標CD62p是血小板活化的特異性分子標志物，它主要位于血小板的α顆粒膜上，同時存在于內(nèi)皮細胞的Weibel-Palada小體膜上，CD62p在未活化的內(nèi)皮細胞膜上有一定數(shù)量的基礎(chǔ)表達，在血小板活化時CD62p與血小板表面的質(zhì)膜融合，并在血小板膜上表達或出現(xiàn)在血漿中［6］。

臨床和實驗研究表明，高脂血癥患者血小板活性增高，易發(fā)生心血管事件，其主要原因是高脂血癥損傷內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，使膠原暴露，促進血小板的黏附和激活;高血脂狀態(tài)下，血小板自身源源不斷地攝取膽固醇(TC)，結(jié)果血小板膜脂質(zhì)中的膽固醇/磷脂比例高于正常，使血小板膜流動性降低，影響血小板膜功能;血小板膜上的鈣離子通道周圍脂質(zhì)發(fā)生改變，鈣內(nèi)流明顯增加，導(dǎo)致凝血活性增強［7-8］。血小板的活化、黏附、聚集以及血小板因子的釋放不但可直接觸發(fā)急性冠脈綜合征，而且還是動脈粥樣硬化的重要致病因素［9］，隨著人們對血小板在心血管疾病發(fā)展進程中關(guān)鍵作用的認識不斷深入，抗血小板藥物治療已經(jīng)成為急性冠脈綜合征和冠狀動脈介入術(shù)等患者預(yù)防和治療的基石［10］，氯吡格雷則是臨床最常用的抗血小板藥物之一。近來許多研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷與質(zhì)子泵抑制劑或他汀類藥物合用會增加患者心血管不良事件的風(fēng)險［11-12］，國內(nèi)亦有關(guān)于中藥與氯吡格雷合用的研究［13-14］。作為活血化瘀代表性的中成藥，復(fù)方丹參滴丸常和氯吡格雷聯(lián)合使用，其目的在于解決氯吡格雷抵抗的問題，但這種聯(lián)合用藥缺少實驗數(shù)據(jù)，存在一定的安全性問題，值得開展研究。本研究結(jié)果表明復(fù)方丹參滴丸對高血脂癥小鼠體質(zhì)量沒有影響，但可降低高血脂癥小鼠升高的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇。高血脂癥小鼠的血小板處于高活化狀態(tài)，復(fù)方丹參滴丸和氯吡格雷均有抑制高血脂癥小鼠血小板活化的作用，兩者聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)，復(fù)方丹參滴丸能顯著增強氯吡格雷抑制血小板活性的作用。

總之，今后還需要大規(guī)模臨床試驗進一步探討復(fù)方丹參滴丸對氯吡格雷藥動學(xué)和藥效學(xué)的影響。另外，復(fù)方丹參滴丸與氯吡格雷之間的相互作用是否的確產(chǎn)生不良轉(zhuǎn)歸尚須進一步評價，因為藥理學(xué)上明顯的藥物間相互作用，不一定就會在臨床上產(chǎn)生影響。

［1］Fugh-Berman A.Herb-drug interactions［J］.Lancet，2000，355(9198):134-138.

［2］Tachjian A，Maria V，Jahangir A.Use of herbal products and potential interactions in patients with cardiovascular diseases［J］.J Am Coll Cardiol，2010，55(6):515-525.

［3］Sabatine M S，Cannon C P，Gibson C M，et al.Addition of clopidogrel to aspirin and fibrinolytic therapy for myocardial infarction with ST-segment elevation［J］.N Engl J Med，2005，352(12):1179-1189.

［4］王怡，高秀梅，張伯禮.復(fù)方丹參滴丸治療心血管疾病的藥理與臨床研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，21(3):53-54.

［5］袁如玉，李廣平.復(fù)方丹參滴丸在心血管疾病防治中的多靶點作用［J］.中國新藥雜志，2009，18(5):377-380.

［6］Cambien B，Wagner D D.A new role in hemostasis for the adhesion receptor P-selectin［J］.Trends Mol Med，2004，10(4):179-86.

［7］Htun P，F(xiàn)ateh-Moghadam S，Tomandl B，et al.Course of platelet activation and platelet-leukocyte interaction in cerebrovascular ischemia［J］.Stroke，2006，37(9):2283-2287.

［8］Sch?fer A，Bauersachs J.Endothelial dysfunction，impaired endogenous platelet inhibition and platelet activation in diabetes and atherosclerosis［J］.Curr Vasc Pharmacol，2008，6(1):52-60.

［9］項榮，郭紅山，孫開琪.血小板:動脈粥樣硬化的誘導(dǎo)者和推動者［J］.中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2010，32(5):777-780.

［10］Angiolillo D J，Suryadevara S，Capranzano P，et al.Prasugrel:a novel platelet ADP P2Y12 receptor antagonist.A review on its mechanism of action and clinical development［J］.Expert Opin Pharmacother，2008，9(16):2893-2900.

［11］張子龍.氯吡格雷與他汀類藥物的相互作用研究進展［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，30(4):376-378.

［12］Ho P M，Maddox T M，Wang L，et al.Risk of adverse outcomes associated with concomitant use of clopidogrel and proton pump inhibitors following acute coronary syndrome［J］.JAMA，2009，301(9):937-944.

［13］吳彩鳳，殷惠軍，王景尚.抗血小板藥物抵抗［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(2):221-224.

［14］李麗，李艷紅，王寧生.當(dāng)歸、紅花與硫酸氫氯吡格雷抗血小板聚集的相互作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1):14-17.