任彥榮

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶400067)

青蒿素是一種具有高效抗瘧作用的活性成分，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。但由于其油溶性和水溶性均較差，很難制成合適的劑型，加之復(fù)燃率高等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。因此通過(guò)對(duì)青蒿素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以期得到性能理想的衍生物成為研究的熱點(diǎn)。從上世紀(jì)七十年代開始到現(xiàn)在，已經(jīng)合成了成千上萬(wàn)種青蒿素衍生物。合成的思路主要基于以下兩個(gè)方面:(1)保留過(guò)氧橋活性中心，主要對(duì)12位碳原子進(jìn)行修飾，將親脂性、親水性基團(tuán)引入結(jié)構(gòu)中改善溶解性，基團(tuán)主要有醚類、酯類和雜原子取代等。(2)合成雙活性基團(tuán)衍生物。通過(guò)雙青蒿素分子間脫水，以及用二元酸、二元醇為連接鏈段的青蒿素酯類或醚類二聚體;或者將具有生理活性的大分子如甾體等引入青蒿素結(jié)構(gòu)中，以增強(qiáng)穩(wěn)定性。雖然目前已合成出眾多衍生物，但仍然沒(méi)找到比目前上市的蒿甲醚、蒿乙醚、雙氫青蒿素和青蒿琥酯效果更好的化合物。而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大劑量長(zhǎng)期使用上述藥物，可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及心電圖的變化，這些藥物仍具有復(fù)燃率高、半衰期短及口服生物利用度低等缺點(diǎn)。青蒿琥酯在水中不穩(wěn)定，必須用前溶解于碳酸氫鈉制成鈉鹽，使用不方便。因此如何更好地解決以上問(wèn)題，尋找溶解性更好、毒理作用更小的衍生物，具有重要的意義。由于糖是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，具有良好的溶解性能和多種生理藥理功能，近年來(lái)在藥物修飾中得到廣泛應(yīng)用。另有研究顯示酶催化合成反應(yīng)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)條件較溫和、對(duì)環(huán)境較友好，目標(biāo)產(chǎn)物簡(jiǎn)單、具有高度區(qū)域和立體選擇性，且易于分離純化，合成路線簡(jiǎn)化。因此，本研究基于糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖苷化反應(yīng)的原理，采用生物酶催化的方法對(duì)青蒿素進(jìn)行糖基化修飾。由于糖基轉(zhuǎn)移酶具有嚴(yán)格的底物專一性［1］，以應(yīng)用廣泛的半乳糖為底物，確定了優(yōu)化的反應(yīng)條件，最終合成一種半乳糖基青蒿素衍生物(見圖1)，然后對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，相關(guān)研究證實(shí)，青蒿素及其衍生物可明顯抑制癌細(xì)胞活性［2-6］，基于此，本研究檢測(cè)了其體外抗癌活性。

圖1 合成路線Fig.1 Synthetic route of glycosylated artemisinin

1 材料與儀器

1.1 藥物與儀器青蒿素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;半乳糖、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胰酶、蛋白酶K、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)均為Sigma公司產(chǎn)品。由Varian INOVA-400型核磁共振儀測(cè)定1HNMR;由Finnigan-MAT 4510型質(zhì)譜儀測(cè)定MS;由美國(guó)熱電Varon傅立葉紅外光譜儀測(cè)定IR。

1.2 細(xì)胞株人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 合成方法確定和工藝條件優(yōu)化本研究選擇在食品中常見的、應(yīng)用廣泛的葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖為底物。因目前商品化的糖基轉(zhuǎn)移酶并不多，本研究選擇底物專一性很強(qiáng)的半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶催化半乳糖底物，葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化其他3種底物。采用薄層層析法對(duì)糖基化反應(yīng)的可行性進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，以核糖和果糖為底物時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生糖基化衍生物，而葡萄糖和核糖會(huì)發(fā)生微量自聚集現(xiàn)象，影響產(chǎn)物質(zhì)量。而以半乳糖為底物時(shí)，催化反應(yīng)效率最高，底物較穩(wěn)定，無(wú)自聚現(xiàn)象。因此最終確定以半乳糖為底物。

通過(guò)對(duì)生物酶催化合成青蒿素半乳糖苷的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分析了不同緩沖體系、溫度、時(shí)間以及攪拌速率對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，緩沖體系的pH值與酶催化反應(yīng)關(guān)系最為密切，pH值在7～8范圍其酶活性最好。反應(yīng)溫度、時(shí)間、半乳糖用量及攪拌速率等因素均對(duì)反應(yīng)的效率有一定影響。根據(jù)青蒿素半乳糖苷糖基化百分率，確定最佳反應(yīng)條件為:10 mL反應(yīng)體系中，采用pH為7.4的磷酸緩沖液，半乳糖10 mmol，反應(yīng)溫度32℃，攪拌速率(轉(zhuǎn)速)200 r/min，反應(yīng)時(shí)間6 h。

2.2 青蒿素半乳糖苷的酶催化合成與表征以半乳糖為給體原料，半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化酶，按文獻(xiàn)［7］的方法制備半乳糖尿苷酸(UDP)衍生物的糖基給體。將5 mmol(1.410 7 g)二氫青蒿素溶于50 mmol/L的NaN3中，加入U(xiǎn)DP活化的10 mmol半乳糖糖基給體及5 μmol半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶，磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋至10 mL，32℃、200 r/min孵育6 h。然后在50 mmol/L的NaN3和磷酸緩沖液(pH7.4)中充分透析，以去除未結(jié)合的糖分子。本合成反應(yīng)在NaN3保護(hù)體系中進(jìn)行，可防止反應(yīng)體系與空氣中的O2接觸發(fā)生氧化。結(jié)果顯示半乳糖糖基化百分率達(dá)68%，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)證實(shí)，產(chǎn)物達(dá)到電泳純的純度。

合成產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù):1H NMR(CDCl3)δ:5.44(s，1H，CH)，4.96(d，1H，J=6.7 Hz，CH)，4.92(d，1H，J=3.4 Hz，CH)，3.43～3.76(m，6H，CH and CH2，為糖環(huán)質(zhì)子信號(hào))，1.26(s，3H，CH3)，0.91(d，3H，J=6.5 Hz，CH3)，0.82(d，3H，J=6.2 Hz，CH3);13C NMR(CDCl3):8.5，14.5，16.6，18.7，19.5，24.8，27.2，30.1，30.8，30.5，31.7，62.5，68.1，69.0，73.1，72.1，84.3，92.4，92.8，96.1，97.9;LCMS(APCI:CHCl3)m/z(%):445.48(M-1+，100);IR(KBr cm－1)Vmax:3 380，2 946，2 935，1 135，1 027，1 014。

1H NMR中δ5.44、4.92、1.26、0.91、0.82與二氫青蒿素的特征吸收峰相同，δ4.96為連接二氫青蒿素的半乳糖分子端基碳上的H原子，其J值為6.7 Hz，表明半乳糖端基C為β構(gòu)型。13C NMR譜中共有21個(gè)信號(hào)(溶劑峰除外)，每分子青蒿素半乳糖苷共有21個(gè)碳原子，其中15個(gè)位于母體青蒿素分子，6個(gè)位于半乳糖分子，由此可確定目標(biāo)產(chǎn)物為青蒿素半乳糖苷。

2.3 青蒿素半乳糖苷體外抗癌作用

2.3.1 青蒿素半乳糖苷對(duì)癌細(xì)胞抑制作用以青蒿素作對(duì)照，用MTT法測(cè)定青蒿素半乳糖苷的對(duì)癌細(xì)胞活性的抑制作用。根據(jù)文獻(xiàn)［8］，IMDM培養(yǎng)液將青蒿素半乳糖苷或青蒿素稀釋配成40 μmol/L的工作液;單層培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后配成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，密度4×104個(gè)/孔，每孔200 μL，37℃、5%CO2、相對(duì)濕度100%條件下培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入青蒿素半乳糖苷或青蒿素工作液，繼續(xù)培養(yǎng)8、12、24、48、72 h。結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，孵育，終止培養(yǎng)后棄上清培養(yǎng)液，加入DMSO，振蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm和630 nm波長(zhǎng)吸光度值A(chǔ)，按下述公式計(jì)算癌細(xì)胞抑制率，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件對(duì)組間結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果如圖2所示，青蒿素半乳糖苷可顯著抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且抑制效果顯著高于青蒿素對(duì)照組(P＜0.01)。隨著青蒿素半乳糖苷處理細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率逐漸增大，表明在一定范圍內(nèi)，其對(duì)癌細(xì)胞抑瘤效果具有明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

圖2 青蒿素半乳糖苷與青蒿素對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用比較Fig.2 Inhibitory action of galactosylated artemisinin and artemisinin on proliferation of He-La cell

2.3.2 青蒿素半乳糖苷對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響樣本細(xì)胞數(shù)調(diào)至1.5×106mL－1，孵育緩沖液(CaCl25 mmol/L，HEPES/NaOH 10 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，pH7.4)洗1次，避光室溫孵育15 min，孵育緩沖液洗1次，滴加Hoechst33342和PI染液，4℃孵育20 min，熒光顯微鏡觀察，波長(zhǎng)488 nm和560 nm激發(fā)光分別檢測(cè)Hoechst33342和PI。

結(jié)果如圖3，HeLa細(xì)胞經(jīng)藥物作用48 h后，青蒿素半乳糖苷處理的癌細(xì)胞呈現(xiàn)大量濃染或碎裂染色特征的細(xì)胞核，表明大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，而青蒿素處理的HeLa細(xì)胞呈均一染色的正常細(xì)胞核較多，而呈現(xiàn)上述凋亡現(xiàn)象的細(xì)胞較少，表明青蒿素半乳糖苷可顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其效果明顯優(yōu)于青蒿素。

圖3 青蒿素半乳糖苷對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of galactosylated artemisimin on apoptosis of cancer cell

3 討論

目前關(guān)于青蒿素糖基化的酶催化合成沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究首次利用糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)催化青蒿素的糖基化反應(yīng)，最終產(chǎn)物經(jīng)過(guò)表征，確定其為青蒿素半乳糖苷。與化學(xué)合成方法相比，利用酶催化反應(yīng)可大幅度提高合成效率，而且半乳糖轉(zhuǎn)移酶的底物專一性很強(qiáng)，僅催化半乳糖基給體發(fā)生反應(yīng)。另外，酶催化合成青蒿素糖基化衍生物還具有反應(yīng)條件溫和，操作方便易行，合成過(guò)程中無(wú)毒性物質(zhì)產(chǎn)生，目標(biāo)產(chǎn)物易于分離純化、純度高等優(yōu)勢(shì)，具有推廣意義。雖然利用糖基轉(zhuǎn)移酶合成青蒿素半乳糖苷類化合物具有一些化學(xué)方法所無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但仍然存在一些問(wèn)題，如原料價(jià)格較為昂貴，造成其應(yīng)用的成本高，難以規(guī)?；瘧?yīng)用;另外，酶的穩(wěn)定性和溶解性在后續(xù)研究中還有待改進(jìn)，可通過(guò)固化、生物反應(yīng)器等方法，使其能夠規(guī)?；a(chǎn)，這都是未來(lái)需解決的問(wèn)題。

本研究進(jìn)一步研究了青蒿素半乳糖苷的抗癌活性。目前關(guān)于青蒿素及其衍生物抗腫瘤的機(jī)制尚未完全闡明［9-10］，文獻(xiàn)報(bào)道的機(jī)制顯示關(guān)鍵可能在于細(xì)胞周期的調(diào)控［11-13］。本研究將糖基化青蒿素與青蒿素比較，初步探討了兩者對(duì)癌細(xì)胞的作用。根據(jù)文獻(xiàn)［8］中青蒿素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及前期研究［14］，得出了不同劑量(10、20、40、80、160、320 μmol/L)半乳糖基化青蒿素作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，濃度40 μmol/L最為接近引起50%細(xì)胞死亡(IC50)的濃度，所以本研究以IC50濃度40 μmol/L作為效應(yīng)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示半乳糖基化修飾后青蒿素衍生物與青蒿素相比抗腫瘤作用顯著提高，具有明確的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，這可能與糖基化修飾后青蒿素衍生物水溶性、親和性或者生物利用效率的提高有關(guān)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。該研究不僅為糖基化修飾的青蒿素衍生物合成提供了新的方向，也為明確青蒿素半乳糖苷的抗癌活性提供了初步依據(jù)。

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