石 鑫 宋 麗 蘇 琦 劉雅文程 熠

(吉林大學白求恩第一醫(yī)院心血管診治中心，吉林 長春 130021)

凝血酶與血小板上凝血酶受體結合，是血小板激活信號轉導的重要環(huán)節(jié)〔1，2〕。凝血酶受體包括:蛋白酶激活受體1(protease-activated receptor 1，PAR1)、PAR4〔3〕和血小板糖蛋白 IbⅨ-Ⅴ(GPIb-Ⅸ-Ⅴ)復合體。GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體是表達在血小板膜表面的膜受體，凝血酶高親和力結合位點位于GPIbα上，凝血酶與GPIbα結合可促進血小板對低濃度凝血酶的反應〔4〕。研究凝血酶與血小板上凝血酶受體的相互作用，以及凝血酶誘導的血小板激活過程對于深入了解止血及血栓形成和血栓疾病的發(fā)病機制有極其重要的意義。

1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體與凝血酶結構

1.1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體的結構 每個血小板上大約有25000個GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體。血小板GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體由四種不同的多肽鏈構成，分別為GPIbα，GPIbβ(GPIbα與GPIbβ通過二硫鍵共價連接)，GPIX，GPV。GPIb，GPIX，GPV 的分子數(shù)之比為 2∶2∶1〔5〕。

1.2 凝血酶的結構 凝血酶是在凝血瀑布級聯(lián)反應中重要的蛋白酶，它既可將血液循環(huán)中的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，又是血小板活化的強效激動劑〔1，6〕。凝血酶由一個含36個殘基的A鏈和一個含259個殘基的B鏈組成。凝血酶包含一個催化活性位點及二個識別結構域(exositeⅠ和exositeⅡ)〔7〕。凝血酶的exositeⅠ和exositeⅡ都是血小板 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體GPIbα亞基的作用位點。凝血酶exositeⅠ與GPIbα可能存在較弱的作用。水蛭素通過競爭凝血酶exositeⅠ，抑制凝血酶與GPIb的結合，化學修飾或用水蛭素封閉exositeⅠ可降低凝血酶誘導的血小板5-羥色胺釋放及聚集〔8〕。然而，由于對exositeⅠ定點突變研究較少，exositeⅠ與GPIbα的相互作用尚待進一步研究。肝素和凝血酶原片段2可與exositeⅡ結合，它們干擾凝血酶與血小板GPIbα的結合〔9〕;加之，凝血酶exositeⅡ突變體降低凝血酶與GPIb結合，這些都表明exositeⅡ是凝血酶識別GPIb的重要結構域。

1.3 GPIbα 與凝血酶復合體的結構 Celikel〔10〕和 Dumas等〔11〕研究了GPIbα片段和凝血酶復合體的晶體結構。GPIbα-凝血酶復合體主要以1∶1形式存在，但雙方在凝血酶exosites和GPIbα之間的相互作用的認識存在差異。Dumas等人認為凝血酶exositeⅠ的相互作用主要是極性的，而Celikel等則認為是疏水作用。在Celikel等研究的結構中，exositeⅠ的相互作用包括GPIbα的硫酸化酪氨酸，而在Dumas等研究的結構中并不包括。此外，雙方關于主體GPIbα的陰離子區(qū)的位置卻是完全不同的。不過，雙方都認為GPIbα陰離子區(qū)和凝血酶exositeⅡ之間存在較強的相互作用。GPIbα的Tyr276-Tyr279序列都與凝血酶exositeⅡ相互作用，Leu275在定位硫酸化Tyr276的側鏈起作用。定點突變研究發(fā)現(xiàn):GPIbα的Leu275-Tyr279序列與exositeⅡ中6個氨基酸殘基中的5個相互作用。

當幾個凝血酶分子結合到多聚纖維蛋白表面，凝血酶exositeⅠ和exositeⅡ交替與GPIbα相互作用促使GPIbα發(fā)生交聯(lián)。對應GPIbα Tyr276-Tyr279區(qū)外的多肽能夠阻止GPIbα受體交聯(lián)，但不能通過凝血酶exositeⅡ抑制GPIbα與凝血酶的相互作用，這正是這些多肽不能抑制凝血酶的結合但能抑制血小板聚集的原因，敲除GPV可促進GPIbα二聚體化〔12〕。由此可見，GPIbα的交聯(lián)是由凝血酶和GPIbα相互作用引起信號轉導所必需。

2 凝血酶與GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體的相互作用

2.1 凝血酶與GPV的相互作用 GPV是血小板表面的凝血酶底物〔13〕，是凝血酶誘導的血小板激活的重要調控因子〔14〕，在凝血酶誘導的血小板聚集的早期，凝血酶切割GPV鏈Arg460和Gly461〔15〕，凝血酶誘導的血小板最大激活常伴隨＞1%的GPV水解〔16〕。

2.2 凝血酶與GPIbα的相互作用 GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體的配體結合區(qū)主要位于GPIbα鏈的N-末端的球狀區(qū)，這是通過GPIbα合成肽、蛋白水解片段及定點突變體證實的。對應GPIbα負電荷區(qū)域的多肽不但會抑制凝血酶結合，也會抑制凝血酶誘導的血小板聚集。對應GPIbα負電荷區(qū)域的上游區(qū)域(Phe247-Thr265)的多肽也會抑制GPIbα與凝血酶結合，盡管程度會低一些;然而，這種多肽對凝血酶誘導的血小板聚集無影響。GPIbα的Phe216-Thr240殘基組成的多肽可抑制凝血酶誘導的血小板聚集，但不會抑制凝血酶與GPIbα結合。因此，GPIbα的負電荷區(qū)域是凝血酶的結合位點〔17〕。

GPIbα的負電荷區(qū)域包含三個硫酸化的酪氨酸殘基(Tyr276，Tyr278，Tyr279)，酪氨酸殘基的硫酸化是 GPIbα 與凝血酶相互作用的基礎。加之，水蛭素、凝血因子V及纖維蛋白的酪氨酸硫酸化也有利于它們與凝血酶結合。這提示，凝血酶傾向與酪氨酸殘基硫酸化的蛋白相互作用。

2.3 少于5%的GPIbα受體結合凝血酶 凝血酶與GPIbα結合是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導的前提，然而只有少于5%的GPIbα受體結合凝血酶。研究發(fā)現(xiàn):部分GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體位于脂筏上，脂筏的破壞導致無催化活性的凝血酶誘導的GPIb介導的血小板的黏附急劇減少〔18〕。膽固醇的存在和受體簇集是脂筏的兩大特征。通過增加膽固醇的富集及減少膽固醇消耗，血小板上凝血酶的高親和位點數(shù)增加;GPIbα受體交聯(lián)體現(xiàn)脂筏信號轉導的受體簇集特性，GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體是否定位于脂筏是GPIbα受體交聯(lián)和凝血酶信號轉導的必要條件。這可能是只有少于5%的GPIbα受體在血小板膜上是凝血酶高親和力受體的原因〔19〕。

此外，GPIbα胞質尾部通過細絲蛋白與血小板膜骨架連結，對GPIb-VWF相互作用有很強的負調節(jié)作用〔20〕。因此，游離的GPIbα和與血小板膜骨架連結的GPIbα的比例，也為為什么只有少于5%的GPIbα受體在血小板膜上是凝血酶高親和力受體，提供了另一種解釋。但目前尚缺文獻的進一步證實。

3 GPIbα介導的血小板凝血酶信號轉導通路

3.1 凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導通路的證實 在低濃度凝血酶的條件下，凝血酶誘導的血小板活化依賴GPIbα。Ramakrishnan等〔16〕使用敲除GPV的鼠血小板和用蛋白酶酶解消除GPV的人血小板，發(fā)現(xiàn):即使GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體中沒有GPV的存在，無催化活性的凝血酶仍能誘導血小板的信號，導致血小板的聚集。Soslau等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)在PAR1失敏的情況下，凝血酶依賴于GPIbα并利用纖維蛋白發(fā)揮作用，誘導血小板激活。上述研究結果進一步印證了GPIbα與凝血酶相互作用引發(fā)的血小板激活信號轉導通路的存在。

3.2 GPIbα介導的血小板凝血酶信號轉導 使用無催化活性的凝血酶可以研究依賴GPIb而獨立于PAR的信號轉導通路。在這種情況下，血小板黏附，致密顆粒分泌，整合素αIIbβ3依賴血小板相互作用伴隨ADP分泌而同時發(fā)生。分泌的ADP在GPIb介導的血小板活化的過程中起著主要的作用，而環(huán)腺苷酸(cyclic AMP，cAMP)的濃度又可調節(jié)GPIb介導的血小板活化。參與這一信號轉導的激酶包括:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Src 家族激酶(Src family kinases，SFKs)和蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)〔22〕。使用 PI3K和PKC抑制劑抑制血小板相互作用和蛋白酪氨酸磷酸化的結果表明:PKC的激活是GPIb介導的血小板凝血酶信號轉導通路的重要環(huán)節(jié)。Dubois等〔23〕研究表明在PAR1和PAR4失敏的情況下，凝血酶和GPIbα結合也可引起纖維蛋白依賴的血小板聚集，這一過程涉及Rho激酶(Rho kinase)和p160 Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(p160 Rho associated coiledcoil forming protein kinase，p160ROCK)的激活，絲裂原活化蛋白激酶激酶-1(mitogen-activated protein kinase kinase1，MEK-1)磷酸化和踝蛋白(talin)切割。

4 GPIbα與其它受體的相互作用

GPIbα與其它受體的相互作用也是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導的重要組成。由于蛋白酶酶解消化的血小板或巨大血小板綜合征〔24〕患者的血小板，缺少GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體或具有喪失功能的GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體，這些血小板都不能與低濃度凝血酶反應。加之，GPIbα與凝血酶的結合先于凝血酶對PAR1的水解〔25〕。Furman等〔26〕研究還發(fā)現(xiàn) PAR1的41個氨基酸裂解肽(TR1-41)可引起從血小板表面到表面連接的小管系統(tǒng)GPIb、GPIX、GPV的重分配，從而負調節(jié)血管性血友病因子(VWF)和凝血酶與GPIbα結合位點。Lova等〔27〕研究表明凝血酶或選擇性激活肽激活PAR1和PAR4，刺激磷脂酶C、酪氨酸激酶和小GTP酶Rap1b，可促進肌動蛋白聚合和細胞骨架重組。但是當血小板PAR1和PAR4失敏時，高濃度的凝血酶不能激活Rap1b，但可激活磷脂酶C。一旦金屬蛋白酶mocarhagin水解GPIbα，這些事件將被中止。這提示，GPIbα對凝血酶激活PAR具有輔助作用。

此外，Sun等〔28〕通過使用酵母雙雜交系統(tǒng)和誘變因素發(fā)現(xiàn)GPIbα和FcγⅡA受體可相互作用，GPIbα殘基 Arg542Gly543Arg544與FcγⅡA受體Asp298Asp299Asp300是主要的相互作用位點，并證實GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化的信號轉導通路部分是通過FcγⅡA受體介導。

5 結語

越來越多的證據(jù)表明GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合體是凝血酶受體，凝血酶與GPIbα相互作用、GPIbα受體交聯(lián)等凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導通路研究已取得長足的進展。此外，GPIbα與其它受體相互作用提示GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化信號轉導通路的復雜性。清楚闡釋凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導通路和血小板活化，將為預防和深入認識老年血栓疾病奠定基礎，因此凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號轉導通路有待于進一步研究。

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