劉 陽 李 莉 (三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院心血管病研究所，湖北 宜昌 443001)

近年研究表明，蛋白酶激活受體－2(PAR－2)活化能明顯縮小心肌缺血再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)后的梗死面積，改善心臟功能〔1〕，但其機制尚未完全清楚。本實驗采用大鼠心肌IR模型，觀察不同劑量的SLIGRL－NH2活化PAR－2對大鼠心肌組織 Bax、Bcl－2 mRNA 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及處理 體重220～250 g的雄性SD大鼠40只，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，動物合格證號為〔SCXK(鄂)2004－0007〕。隨機分為假手術(shù)(sham)組、I/R 組和 SLIGRL－NH2(0.5，1，3 mg)組，每組 8 只。SLIGRL－NH2組:再灌注前5 min經(jīng)頸外靜脈注射0.5、1、3 mg/kg SLIGRLNH2，假手術(shù)組和I/R組注射等量生理鹽水作為對照。SLIGRL－NH2(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

1.2 試劑與儀器 TRIZOL REAGENT，美國Invitrogen公司產(chǎn)品;SYBR ExScript TMRT－PCR kit(Perfect Real Time)，Takara 公司產(chǎn)品;熒光定量PCR擴增儀，美國MJ Research公司產(chǎn)品。

1.3 動物模型的制作 按文獻〔2〕復(fù)制模型，以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，氣管切開插管連接微型動物呼吸機。輔助呼吸參數(shù)為:呼吸頻率 50次/min，潮氣量20 ml/kg，呼吸比1∶1。大頭針穿刺四肢皮下接心電圖機記錄一段正常心電圖作為對照。開胸、暴露心臟。I/R組和SLIGRL－NH2組以5/0縫線在左冠狀動脈前降支根部穿線，在前降支上墊一塑料管一同結(jié)扎，缺血30 min后，剪斷結(jié)扎線再灌注120 min。假手術(shù)組僅在左前降支下穿線不結(jié)扎，曠置150 min。1.4 大鼠心肌組織Bax、Bcl－2 mRNA表達的檢測

1.4.1 抽提總RNA 心肌組織樣本用 TRIZOL Reagent提取總RNA，按操作說明書進行。紫外分光光度分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度及完整性。引物序列如下:①目的基因 Bcl－2 上游引物序列:5′－TGAACCGGCATCTGCACAC－3′;下游引物序列:5′－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3′。② Bax上游引物序列:5′－AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG－3′;下游引物序列:5′－GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA－3′。③內(nèi)參照基因 β－actin 上游引物序列 5′－GTCCCTCACCCTCCCAAAAG－3′，下游引物序列 5′－GCTGCCTCAACACCTCAACCC－3′。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在2700型PCR擴增儀上按SYBR Ex－Script TMRT－PCR kit反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進行cDNA的合成，反應(yīng)參數(shù)為:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)95℃2 min。

1.4.3 PCR反應(yīng) 采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit，在熒光定量PCR儀上進行 PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性 10 s，1 個循環(huán);95℃變性 5 s，60℃退火31 s，共40個循環(huán)。整個過程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，使用 Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程各樣本的Ct(threshold cycle)值，Ct值隨模板濃度增大而減少。由熔解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性，用2－△△CT方法分析各組間的差異〔3〕。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS10.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織Bax mRNA表達的變化 分別擴增β－actin和Bax，每樣本作2復(fù)孔，得到兩組 Ct平均值。通過2－△△CT計算Bax相對mRNA表達水平，△CT intervention=CT intervention Bax － CT intervention β－actin，△CT blank=CT blank Bax － CT blank β－actin，△△CT = △CT intervention － △CT blank，Bax mRNA表達差別以 2－△△CT表示。I/R 組 Bax 2－△△CT(3.98 ±0.41)顯著多于假手術(shù)組(1.0±0.21，P＜0.01)，表明 I/R組Bax mRNA表達上調(diào);與I/R組比較，SLIGRL－NH2各劑量組隨著給藥劑量的增加Bax mRNA表達下調(diào)，低、中、高劑量組分別為3.78±0.32，3.37±0.36，3.09±0.28。

2.2 大鼠心肌組織Bcl－2 mRNA表達的變化同樣采用2－△△CT的方法比較各組心肌Bcl－2 mRNA的表達水平。結(jié)果顯示:I/R組 Bcl－22－△△CT(1.42±0.25)顯著多于假手術(shù)組(1.0 ±0.19，P＜0.01)，表明I/R組Bcl－2 mRNA表達上調(diào);與I/R組比較，SLIGRL－NH2各劑量組2－△△CT顯著減少，低、中、高劑量組分別為1.79 ±0.39，2.09 ±0.32，2.47 ±0.28。表明 Bcl－2 mRNA 表達上調(diào)，且該效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。

3 討論

心肌I/R損傷有心肌梗死、心肌頓抑、收縮功能減退等表現(xiàn)。多年來，I/R損傷一直是臨床難以解決的問題。心肌I/R損傷的機制十分復(fù)雜，心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷心肌細胞死亡的重要機制之一。

細胞凋亡的具體機制涉及一系列基因的復(fù)雜調(diào)控，不同細胞的凋亡調(diào)節(jié)也存在差異。細胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因分兩類，誘導(dǎo)凋亡基因和抑制凋亡基因。在心肌細胞凋亡中Bcl－2家族是不可缺少的，Bcl－2是重要的抗凋亡基因，在細胞色素C的釋放調(diào)控中起重要作用〔4〕。Bcl－2與Bax是一對相互拮抗的蛋白質(zhì)，它們形成二聚體，拮抗對方的功能，Bcl－2具有明顯抑制凋亡作用，而Bax則促進細胞凋亡。Bax和Bcl－2形成復(fù)合體而失去作用。由此可見，損傷刺激后，Bax和Bcl－2表達的比率在很大程度影響凋亡的產(chǎn)生〔5〕。

蛋白酶活化受體(PARs)屬于G蛋白耦聯(lián)的細胞表面受體超家族成員，能通過特殊的蛋白水解機制活化。PAR－2即胰蛋白酶受體，不僅能夠改善血流動力學(xué)，還能促進細胞增殖、抑制細胞凋亡〔6〕。諸多研究表明，PAR－2在缺血再灌注損傷中具有重要的保護作用〔7〕。本研究通過動物實驗，觀察了PAR－2活化劑對I/R大鼠心肌凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl－2 mRNA表達的影響。結(jié)果I/R誘導(dǎo)大鼠心肌組織Bcl－2、Bax mRNA表達升高，兩者與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，推測可能是機體對抗損傷的一種保護性代償機制;SLIGRL－NH2組Bcl－2 mRNA表達較I/R組增高，而 Bax mRNA表達降低，并呈一定的劑量依賴性，表明SLIGRL－NH2處理后，大鼠抗細胞凋亡的基因表達上調(diào)。Bax/Bcl－2組成一個平衡體系，Bax過剩則細胞凋亡加速，Bcl－2過多則細胞凋亡被抑制。因此，PAR－2活化抑制心肌細胞凋亡的機制可能為抑制Bax的表達，促進Bcl－2的表達，一定程度上調(diào)節(jié)Bax/Bcl－2之間的平衡來抑制細胞凋亡，減少了心肌細胞的丟失，從而發(fā)揮抗心肌I/R損傷的作用。

1 Bucci M，Roviezzo F，Cirino G.Protease－activated receptor－2(PAR2)in cardiovascular system〔J〕.Vasc Pharmacol，2005;43:247－53.

2 楊 簡，楊 俊，丁家望，等.TOLL樣受體4在大鼠心肌缺血再灌注損傷中表達的實驗研究〔J〕.中華心血管病雜志，2008;36(1):57－61.

3 Marino JH，Cook P.Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real－time RT－PCR〔J〕.J Immunol Methods，2003;283(12):291－306.

4 Wang HQ，Nakaya Yoshifumi，Du ZY，et al.Interaction of p resenilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mitochondrial Bcl－2〔J〕.Human Mol Gen，2005;14(13):1889－902.

5 Yao MZ，Nguyen TV，Pike C，et al.β－Amyloid－induced neuronal apoptosis involves c－jun N－terminal kinase－dependent down－regulation of Bcl－w〔J〕.J Neurosci，2005;25(5):1149－58.

6 McGuire JJ，Van Vliet BN，Giménez J，et al.Persistence of PAR－2 vasodilation despite endothelial dysfunction in BPH/2 hypertensive mice〔J〕.Pflugers Arch，2007;454(4):535－43.

7 Wang Y，Luo W，Reiser G.Activation of protease－activated receptors in astrocytes evokes a novel neuroprotective pathway through release of chemokines of the growth－regulated oncogene/cytokine－induced neutrophil chemoattractant family〔J〕.Eur J Neurosci，2007;26(11):3159－68.