劉婷婷，馬麗娜，李鳳云，劉 勇

傷寒沙門菌（Salmonella typhi）是重要的腸道致病菌，屬胞內寄生菌，可引起傷寒等嚴重疾病。巨噬細胞是人體主要的吞噬細胞，在許多病原體的清除和破壞中起重要作用。傷寒沙門菌在巨噬細胞內生存、增殖的能力與其致病密切相關。傷寒沙門菌侵襲性蛋白Sip－B可以誘導caspase1介導的巨噬細胞凋亡［1］，但這些細菌毒力因子的表達在宿主體內、外是不同的［2］，人體內環(huán)境因素對傷寒沙門菌誘導細胞凋亡的影響還有待于進一步研究，其中就包括傷寒沙門菌被巨噬細胞吞噬后所遭遇的細胞內氧化應激環(huán)境。本實驗擬用H2O2刺激傷寒沙門菌以模擬體內氧化條件，采用人單核細胞株經PMA分化的巨噬細胞為模型，探討傷寒沙門菌在氧化應激狀態(tài)下誘導的巨噬細胞凋亡，以深入了解傷寒沙門菌的致病機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 傷寒沙門菌標準菌株ATCC 19430，購自北京中國藥品生物制品鑒定所；氧化應激傷寒沙門菌，參照文獻［3］方法制備。

1．1．2 主要試劑 Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒（深圳晶美生物工程公司），人TNFα定量酶聯(lián)檢測試劑盒（上海森雄生物技術有限公司），SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1．1．3 主要儀器 流式細胞儀FACS Calibur（美國BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 用含小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人單核細胞株，加入20ng／mL使其分化，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h，鏡下觀察90%以上細胞出現(xiàn)棘狀突起時判定細胞已分化成巨噬細胞。收獲指數(shù)生長期巨噬細胞，以5×105接種于無菌6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)5h后更換不含小牛血清的營養(yǎng)液進行試驗。

1．2．2 細菌培養(yǎng) 細菌分別在LB液體培養(yǎng)基和加有15mmol／L H2O2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，16h后使用酶標儀測A600值；計算菌液濃度，用不含小牛血清的RPMI－1640調整菌液濃度。

1．2．3 細胞感染 棄去細胞培養(yǎng)孔中陳舊培養(yǎng)液，加入1．0mL不含小牛血清營養(yǎng)液，按細菌與細胞數(shù)之比為20∶1加入細菌。實驗分為A組（傷寒沙門菌誘導組）、B組（氧化應激組）和C組（空白對照組）。

1．2．4 細胞凋亡檢測 分別于感染細菌后2、4、8、12h收集細胞，Annexin V－FITC染色，1h內流式細胞儀檢測細胞凋亡，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。

1．2．5 TNF－α、SOD檢測 細菌感染8h后收集細胞培養(yǎng)上清，采用定量酶聯(lián)法檢測TNF－α，按照說明書操作，用酶標儀測A492值，根據(jù)標準曲線得到TNF－α含量。SOD的檢測采用黃嘌呤氧化酶法檢測細菌感染8h細胞培養(yǎng)液上清，用可見光分光光度計在550nm處檢測，通過公式可求出樣本SOD活力。1．2．6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel和SPSS10．0進行計算和分析。采用one－way ANOVA后t檢驗。

2 結 果

2．1 氧化應激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡的流式分析 各時間段氧化應激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌均可誘導巨噬細胞凋亡，與對照組相比細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），隨時間延長，各組細胞凋亡率亦相應增加（P＜0．01）；各時間段氧化應激狀態(tài)下傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡率與自然狀態(tài)傷寒沙門菌組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。

圖1 巨噬細胞凋亡的流式圖A：對照組；B：自然狀態(tài)傷寒沙門菌組；C：氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌組）Fig．1 Time－dependent effect of macrophage apoptosis inducedA：control；B：s．typhi；C：H2O2stressed s．typhi with flow cytometry

圖2 氧化應激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)下傷寒沙門菌誘導巨噬細胞不同時間的細胞凋亡率 （ni＝6，±s）＊：與自然狀態(tài)傷寒沙門菌組及對照組比較Fig．2 Apoptosis rates of macrophage induced by S．typhi grown under normal and H2O2stressed conditionCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

2．2 細菌誘導8h后TNF－α及SOD的產生量氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌組誘導巨噬細胞8h后，TNF－α的產生量均比加入誘導因素前明顯增高，且氧化應激菌TNF－α高于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組；SOD的產生量均比加入誘導因素前明顯減少，且氧化應激菌SOD的產生量均低于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組，見圖4－6。

圖3 自然狀態(tài)傷寒沙門菌及氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞TNF－α產生量 （ni＝6，±s）＊：與對照組及自然狀態(tài)傷寒沙門菌作用巨噬細胞組比較Fig．3 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

3 討 論

圖4 自然狀態(tài)傷寒沙門菌及氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞SOD產生量 （ni＝6，±s）＊：與對照組及自然狀態(tài)傷寒沙門菌作用巨噬細胞組比較Fig．4 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages），P＜0．01

氧化應激即機體活性氧（reactive oxygen specises，ROS）產生過多或／和抗氧化能力下降，ROS清除不足，導致ROS在體內過多堆積而造成細胞損傷。感染過程中，在細胞因子的影響下，傷寒沙門菌遭遇了巨噬細胞內的氧化環(huán)境，巨噬細胞利用其產生的氧衍生物分子以抑制或殺死傷寒沙門菌，但仍有部分傷寒沙門菌在巨噬細胞內生存并導致感染。為了應對環(huán)境的應激，傷寒沙門菌經歷了遺傳以及物理性狀的改變。這些應激反應可能會顯著的增強傷寒沙門菌在巨噬細胞內的生存能力及毒性［4］。本實驗著重探討了傷寒沙門菌如何應對巨噬細胞內的氧化環(huán)境以及巨噬細胞凋亡與ROS之間的關系。

氧化應激狀態(tài)下自然狀態(tài)傷寒沙門菌，采用Annexin V－FITC染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果兩組細菌均可誘導巨噬細胞凋亡，且細胞凋亡率隨時間延長而增高（P＜0．01），各組氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌引發(fā)巨噬細胞凋亡能力均高于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組，說明模擬巨噬細胞內氧化應激條件傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡能力增強。

本實驗結果顯示，氧化應激狀態(tài)傷寒沙門菌組較自然狀態(tài)傷寒沙門菌感染組誘導巨噬細胞產生的SOD明顯降低。SOD是一種重要的抗氧化酶，具有清除自由基，抑制脂質過氧化的作用。SOD水平的下降可能引起過氧化自由基的產生從而引起巨噬細胞的凋亡，已經有報道這種過氧化物可引起神經細胞的凋亡［5］。早期的研究中有人發(fā)現(xiàn)，缺乏SOD的大腸桿菌在需氧生長中突變率增強，這表明缺乏SOD可導致DNA的損害。另外，SOD的顯著減少有可能阻礙了超氧陰離子防止突變以及H2O2的解毒作用，因而可能造成凋亡的羥基離子和其他活性氧成分的形成［6］。

許多研究已證實氧化應激可引起細胞凋亡，這其中凋亡可由活性氧中間物產生，也可由抗氧化劑的使用而被阻止。TNF－α就是這樣一種調劑因子。Larrick和Wright曾報導給予TNF受體刺激后可導致細胞內活性氧中間物水平的迅速上升［7］。而且在不同的細胞，TNF－α介導的細胞凋亡可由硫氧化還原劑，或 N－已酰半胱氨酸，和GSH 前體所抑制［8］。TNF－α，INF－α和IL－1也曾經被報道可引起不同類型細胞凋亡［9］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)氧化應激下傷寒沙門菌組較原菌感染組誘導巨噬細胞釋放的TNF－α明顯增多，這個結果跟Hirose早期研究發(fā)現(xiàn)細胞對TNF－α敏感度和抵抗力是和SOD水平的降低或升高密切相關是一致的，SOD缺陷的T細胞已被證實更易被 TNF－α殺傷［10］。

氧化應激狀態(tài)下傷寒沙門菌可誘導巨噬細胞凋亡，TNF－α在傷寒沙門菌氧化應激時通過增加ROS和減少抗氧化物SOD的產生來介導巨噬細胞凋亡，本研究結果有助于我們更好的理解傷寒沙門菌的致病機理，為我們進一步的診斷與治療提供了新的思路。

［1］Hersh D，Monack DM，Smith MR，et al．The Salmonellainvasion Sip B induces macrophage apoptosis by binding to caspase－1［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（5）：396－401．

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［3］Ozkanca R，Sahin N，Isik K，et al．The effect of toluidine blue on the survival，dormancy and outer member porin proteins（OmpC and OmpF）and Salmonella typhimurium LT2in seawater［J］．J Appl Microbiol，2002，92（6）：1097－1104．

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［5］Troy CM，Shelanski ML．Down－regulation of Copper／Zinc superoxide dismutase causes apoptotic cell death in PCL2neuronal cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（14）：6384－6387．

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［7］Larrick JW，Wright SC．Cytotoxic mechanism of tumor necrosis factor－alpha［J］．FASEB J，1990，4（14）：3215－3223．

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