付宇姣，鄭學(xué)禮

登革病毒（DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是最常見(jiàn)的通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物（伊蚊）傳播的病毒性疾病病原體，分布于全球100多個(gè)國(guó)家，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。全球大約有25億人受登革病毒感染的威脅，每年大約有5 000萬(wàn)人感染登革熱，其中大約有210萬(wàn)的嚴(yán)重病例，50萬(wàn)例登革出血熱，20 000例死亡病例。登革病毒感染引起的病變范圍很廣，從自限性疾病到嚴(yán)重危及生命的登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合征［2－4］。登革熱／登革出血熱已成為熱帶地區(qū)最為重要的蚊－傳播病毒性疾病，是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［5］。

登革病毒是一個(gè)正義單鏈RNA病毒。登革病毒基因組RNA編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、E、prM／M）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5），分為4個(gè)典型的血清型（DENV1－4）。包膜糖蛋白E是主要的病毒顆粒包膜糖蛋白，以同源三聚體形式存在于成熟病毒顆粒表面。結(jié)晶學(xué)的研究表明，登革病毒的包膜糖蛋白E與其他黃病毒類(lèi)似，分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域（Ⅰ－Ⅲ）［6－9］。在三個(gè)結(jié)構(gòu)中，β鏈形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)是其主要結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域I位于E蛋白單體中央，E蛋白II區(qū)折疊成長(zhǎng)的指樣結(jié)構(gòu)，E蛋白C端的氨基酸殘基構(gòu)成了結(jié)構(gòu)域Ⅲ。因?yàn)樵谒谐墒炀哂懈腥拘缘狞S病毒中E蛋白均是由與病毒融合有關(guān)的同源二聚體形成，推斷E蛋白的所有結(jié)構(gòu)都可能和病毒與細(xì)胞的融合過(guò)程有關(guān)［10］。其中E蛋白II區(qū)中第98～111位氨基酸殘基組成的cd環(huán)，富含甘氨酸且具有很強(qiáng)的疏水性，序列組成在幾乎所有的蟲(chóng)媒黃病毒中高度保守。最近研究發(fā)現(xiàn)，cd環(huán)可在E蛋白由二聚體向三聚體的轉(zhuǎn)變過(guò)程中插入胞膜，參與病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，被認(rèn)為是病毒融合靶點(diǎn)，或認(rèn)為是潛在的病毒融合肽［11－12］。推斷第一、第二結(jié)構(gòu)域可能與登革病毒發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本研究旨在從大腸桿菌中表達(dá)登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二結(jié)構(gòu)域（DI，DII），并通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證重組蛋白的免疫原性，為后續(xù)的功能研究奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 病毒株、菌株和質(zhì)粒 登革Ⅱ型病毒NGC株、大腸桿菌DH5ɑ、表達(dá)菌BL21（DE3）、表達(dá)載體質(zhì)粒pET－28a（＋）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2 主要試劑、耗材 RT－PCR試劑盒、DNAMarker、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)O－mega公司；PVDF膜購(gòu)自millipore公司；Trizol試劑、His·Tag單抗、增強(qiáng)型HRP－DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自英韋創(chuàng)津公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；登革病毒單抗（D1－11）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司；預(yù)染雙色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司。

1．1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用1～3日齡昆明乳鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 方法

1．2．1 引物的合成 引物用Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)引物并由生工生物工程（上海）有限公司合成。RT－PCR擴(kuò)增E蛋白第一，二結(jié)構(gòu)域（DⅠ，Ⅱ）基因片 段 的 引 物：DV2－E－F：5′－CGTCCATATGATGCGTTGCATAG－3′（下劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn) ），DV2－E－R：5′－TCGCCTCGAGTTATCCTTTAGAGC－3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。

1．2．2 乳鼠腦內(nèi)接種病毒傳代 取－70℃保存的登革Ⅱ型病毒，加入DMEM培養(yǎng)基稀釋作為病毒液。用微量注身器每只30μL顱內(nèi)接種1～3d齡昆明乳鼠。接種后5～9d期間的發(fā)病瀕死乳鼠拉頸處死，無(wú)菌取腦組織備總RNA的提取。

1．2．3 目的基因的獲得 發(fā)病乳鼠腦組織的總RNA提取參見(jiàn)Invitrogen公司的Trizol說(shuō)明書(shū)。E蛋白第一、二結(jié)構(gòu)域基因片段的擴(kuò)增參見(jiàn)TaKa－Ra公司的RT－PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，58．1℃退火60 s，72℃延伸120s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。

1．2．4 目的基因的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將目的基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后與經(jīng)XhoⅠ及NdeⅠ酶切純化的表達(dá)載體pET28a（＋），按照TaKaRa公司T4DNA ligase試劑盒說(shuō)明書(shū)連接目的片斷與表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置37℃培養(yǎng)12～16h挑取單菌落，采取菌落PCR法初篩陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海英俊生物工程有限公司測(cè)序，檢查連入的片段有無(wú)堿基突變及開(kāi)放讀碼框是否正確。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a－DV2－E－D1＆2。

1．2．5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞及誘導(dǎo)表達(dá)的SDS－PAGE分析 測(cè)序正確的pET－28a（＋ ）－DV2－E－D1＆2，pET－28a（＋ ），轉(zhuǎn) 化 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于終濃度為50mg／L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0．5，取部分菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照，剩余菌液加入IPTG至終濃度為1mmol／L，37℃振蕩培養(yǎng)3h后收集菌液，沉淀，經(jīng)12%分離膠的SDS－PAGE分析重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)。

1．2．6 重組蛋白的可溶性分析及純化 菌體沉淀重懸于裂解緩沖液中冰浴超聲裂解至澄清，裂解菌液離心后，回收上清及沉淀并加入等體積的裂解緩沖液重懸沉淀，分別取等體積的上清與重懸沉淀經(jīng)12%分離膠的SDS－PAGE分析重組蛋白的可溶性，重組蛋白的純化步驟參見(jiàn)德國(guó)Novagen公司的Ni－NTA His·Bind樹(shù)脂說(shuō)明書(shū)。

1．2．7 Western blot鑒定重組蛋白誘導(dǎo)前后的重組菌全菌蛋白 重組蛋白經(jīng)12%SDS－PAGE分離后，半干轉(zhuǎn)印于 PVDF 膜上，0．3%Tween－20，1%BSA封閉1h后，分別加入1∶3 000稀釋的His·Tag單抗和1∶500稀釋的登革病毒單抗于37℃孵育1．5h，PBST洗膜3次，加入1∶500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h，PBST充分洗膜后按照增強(qiáng)型HRP－DAB底物顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)顯色。

2 結(jié) 果

2．1 以提取的乳鼠總RNA經(jīng)過(guò)RT－PCR擴(kuò)增得到約900bp的E蛋白第一、二結(jié)構(gòu)域基因片段，見(jiàn)圖1。

圖1 E蛋白第一，二結(jié)構(gòu)域基因片段的PCR擴(kuò)增Fig．1 PCR amplification of the envelop protein DNA fragmentLane 1：Products of PCR amplification M：DL－5000marker

2．2 pET28a－DV2－E－D1＆2載體的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pET28a－DV2－E－D1＆2經(jīng)XhoⅠ和 NdeⅠ雙酶切后，可見(jiàn)約900bp的酶切片段，與預(yù)期大小相符，見(jiàn)圖2。測(cè)序分析表明，插入序列正確且開(kāi)放讀碼框正確。

2．3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的SDS－PAGE分析 重組菌BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在37kD位置有明顯的誘導(dǎo)后表達(dá)帶，其大小與預(yù)測(cè)值一致。超聲裂解重組菌后，分別取上清與沉淀經(jīng)12%SDS－PAGE分析，顯示重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，見(jiàn)圖3。

2．4 Western blot鑒定重組蛋白 Western blot結(jié)果顯示，重組菌誘導(dǎo)前的全菌蛋白沒(méi)有與His·Tag單抗反應(yīng)的條帶，而誘導(dǎo)后的全菌蛋白和在相對(duì)分子質(zhì)量為37000的位置均有與His·Tag單抗反應(yīng)的特異條帶，見(jiàn)圖4。登革病毒單抗（D1－11）與重組誘導(dǎo)前的全菌蛋白無(wú)反應(yīng)，只在誘導(dǎo)后的全菌蛋白中有特異的條帶出現(xiàn)，且與預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量為37000的位置相符合，見(jiàn)圖5。上述結(jié)果說(shuō)明，重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖2 重組質(zhì)粒pET－28a－DV2－E－D1＆2的酶切鑒定Fig．2 Identification of the recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2by restriction enzymes digestionLane 1，3：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2；Lane 2，4：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2digested by the restriction enzymes XhoⅠ／NdeⅠ；M ：DL－5000Marker

圖3 BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2重組菌表達(dá)的 SDS－PAGE 分析Fig．3 SDS－PAGE analysis the expression of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2Lane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）before induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）after induction；Lane 3：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；Lane 4：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 5：Supernatant of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 6：Pellet of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 7：Purification of the recombinant protein DV2－E－D1＆2with Ni－NTAHis·Bind Resin；M：Protein marker

圖4 His·tag單克隆抗體鑒定重組DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．4 Western Blot identification of recombinant protein with His·Tag McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

圖5 Dengue Virus（D1－11）的單克隆抗體鑒定重組DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．5 Western blot identification of recombinant protein with DENV（I－IV）McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

3 討 論

登革病毒包膜蛋白E是由494～501個(gè)氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量約為55～60kDa的糖蛋白。E蛋白可形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即呈β桶狀的I區(qū)，參與二聚體形成的II區(qū)和具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的III區(qū)。硫酸乙酰肝素（HS）是廣泛存在于細(xì)胞表面的一類(lèi)由二糖重復(fù)單位組成的多糖，表面具有大量負(fù)電荷，具有包括介導(dǎo)病原體吸附等在內(nèi)的多種生物學(xué)功能。研究表明，登革2型病毒中含高度保守的堿性氨基酸Lys89，Lys122，Lys123，其中I區(qū)和II區(qū)中帶有大量的正電荷Arg和Lys可能有助于病毒與硫酸乙酰肝素結(jié)合。研究也發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素脫硫或經(jīng)酶消化去除后，登革病毒和黃熱病毒與細(xì)胞的結(jié)合能力顯著降低［13］。推斷第一、第二結(jié)構(gòu)域可能與登革病毒發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

本研究中重組表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS－PAGE分析以包涵體的形式存在。分析其形成原因有以下幾方面：蛋白表達(dá)量過(guò)高；重組蛋白含巰基酸多；重組蛋白所處發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)，這些因素均可導(dǎo)致降低蛋白的溶解度，形成包涵體。

本研究成功地在大腸桿菌中表達(dá)登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二結(jié)構(gòu)域（DI，DII），對(duì)其進(jìn)行免疫反應(yīng)性鑒定，鑒定結(jié)果表明其具有良好的免疫反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究第一、二結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞的相互作用和功能及其致病性奠定了基礎(chǔ)。

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