張志珊，嚴(yán)延生，翁育偉

登革熱是由登革病毒引起的急性蟲媒傳染病，廣泛流行熱帶、亞熱帶地區(qū)，100多個國家有地方性登革熱傳播，每年均出現(xiàn)幾百萬病例，其中以東南亞國家最為嚴(yán)重。我國東南沿海一帶長期有輸入性病例，且由此引起的本地暴發(fā)流行越來越頻繁，加強(qiáng)登革病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測，對于控制傳染源，減少疾病的傳播起著至關(guān)重要的作用。

目前登革熱的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病毒分離、基因診斷技術(shù)和血清學(xué)檢測。由于登革熱的病毒血癥期很短，因此病毒分離和基因診斷受到標(biāo)本采集時間的限制，同時對設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室條件及人員素質(zhì)要求很高，不利于推廣。ELISA法、免疫層析法具有較高的敏感性和特異性，且操作簡便快速，是檢測登革熱感染的主要方法。目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要采用澳大利亞Panbio公司生產(chǎn)的檢測試劑盒，但其價格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以承受，且運(yùn)送時間長，難以應(yīng)對突發(fā)事件。而國內(nèi)商業(yè)化的試劑盒其靈敏度和特異性大多不夠理想。本文采用原核系統(tǒng)表達(dá)登革2型病毒外膜蛋白基因，重組蛋白應(yīng)用于血清學(xué)檢測，為進(jìn)一步開發(fā)登革熱血清學(xué)檢測試劑盒打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病毒株、細(xì)胞及血清來源 登革熱病毒2型（NGC株）、C6／36細(xì)胞、登革病毒2型感染者血清、日本腦炎IgG陽性血清由福建省疾病預(yù)防控制中心提供。

1．1．2 質(zhì)粒和主要試劑 表達(dá)載體pET30a、大腸桿菌BL21（DE3）福建省疾病預(yù)防控制中心保存，大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco BRL公司，病毒RNA提取試劑盒、一步法RT－PCR試劑盒購自QIAGEN公司。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自TaKaRa公司。用于血清檢測的酶標(biāo)板條、酶標(biāo)二抗由萬泰公司提供。參比試劑為澳大利亞Panbio生產(chǎn)的IgG捕獲法ELISA檢測試劑盒。

1．2 方法

1．2．1 病毒的增殖及核酸的提取 C6／36細(xì)胞在PRMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，pH7．0）中于33℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至單層后，接種病毒，靜置吸附1h后，加入維持培養(yǎng)液（含2%胎牛血清，pH7．0），培養(yǎng)3d后收集上清，按操作說明書進(jìn)行核酸提取。

1．2．2 目的片段的擴(kuò)增 參考GenBank公布的登革熱病毒2型序列（AF038403）設(shè)計(jì)1對引物用于擴(kuò)增登革2型E蛋白去除C端疏水區(qū)的基因片段。正向 引 物：5′－GTGAATTCATGCGTTGTATTGGAATATCA－3′（劃線部分為引入的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物：5′－GATCTCGAGGAACATTTG－GCCGATTGAG－3′（劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系：5×buffer 10μL，dNTP 2 μL，正、反向引物各2μL，Onestep RT－PCR Enzyme 2μL，RNA 5μL，加水至50μL。按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：50℃30min，95℃15min，然后94℃40s，55℃40s，72℃2min，進(jìn)行30循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1．2．3 表達(dá)載體的構(gòu)建 擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后與表達(dá)載體pET30a連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布含有30μg／mL卡那霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單個菌落，接種LB（含30μg／mL卡那霉素）過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，用BamHI／XhoI雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組克隆重組克隆命名為pET30a－DEN2，用雙脫氧終止法進(jìn)行DNA序列測定，應(yīng)用DNASTAR中的EditSeq和SeqMan軟件對插入片段的序列進(jìn)行分析。

1．2．4 重組蛋白的初步表達(dá) 鑒定正確的重組載體及pET30a空載體（作為對照）同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG（終濃度為1mmol／L）誘導(dǎo)表達(dá)4h后收集菌體，菌體蛋白用SDS－PAGE膠進(jìn)行電泳。操作方法按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［1］進(jìn)行。

1．2．5 重組蛋白的大量表達(dá)及電洗脫純化 按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行［1］。

1．2．6 間接免疫熒光檢測（IFTA） 用登革病毒2型感染后的C6／36細(xì)胞制成抗原片，登革熱病人血清及作為對照的正常人血清用0．01mmol／L PBS進(jìn)行倍比稀釋。具體操作步驟參見文獻(xiàn)［2］。抗體效價以可以看見免疫熒光的血清最高稀釋度表示。

1．2．7 間接ELISA法檢測IgG 用純化的重組抗原包被板條（100ng／孔），37℃作用2h后，PBST洗滌1次，每孔加入封閉液（5%BSA／PBS）200μL，37℃作用2h，棄去孔中液體，加入待檢血清（用樣本稀釋液1∶20稀釋）100μL，37℃作用30min，PBST洗滌5次，加入酶標(biāo)二抗100μL，37℃作用30min后PBST洗滌5次，加入顯色液顯色10min，最后加入2mol／L H2SO4終止反應(yīng)。450nm波長下檢測OD值。以正常對照組血清平均OD值加上2S作為cutoff值［3］。以IFTA為標(biāo)準(zhǔn)，評價重組蛋白檢測登革2型IgG抗體的敏感度和特異性，公式為：敏感性＝真陽性／（真陽性＋假陰性）×100%；特異性＝真陰性／（真陰性＋假陽性）×100%。用重組抗原和澳大利亞Panbio IgG捕獲法ELISA試劑盒同時對標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果用χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié) 果

2．1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ／XhoI雙酶切后電泳，插入片段的大小與預(yù)期的一致（1 206bp），結(jié)果見圖1。同時測序結(jié)果表明，插入片段的序列與原病毒株的序列相符，且讀碼框正確，表明重組載體構(gòu)建成功。

2．2 重組質(zhì)粒的初步表達(dá) 重組蛋白由于融合了表達(dá)載體上58個氨基酸，預(yù)期分子量為50．8kD。重組質(zhì)粒pET30a－DEN2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用12%SDS－PAGE電泳，與對照菌（pET30a轉(zhuǎn)化BL21）相比，在45～66kD之間有一條明顯的蛋白帶，與預(yù)期分子量相符，見圖2。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定1：100bp Ladder DNA marker；2～4：pET30a－DEN2經(jīng)EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切；5：pET30a經(jīng)EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切Fig．1 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion1：100bp Ladder DNA marker；2－4：pET30a－DEN2digested by EcoRⅠ／XhoⅠ；5：pET30adigested by EcoRⅠ／XhoⅠ

圖2 重組質(zhì)粒pET30a－DEN2表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析1：分子量標(biāo)準(zhǔn)（從上至下：66．0、45．0、36．0、29．0、24．0、20．1、14．2kDa）；2：pET30a－DEN2表達(dá)產(chǎn)物；3：pET30a表達(dá)產(chǎn)物Fig．2 SDS－PAGE analysis of expression on recombinant plasmid pET30a－DEN21：Molecule weight marker（from top to bottom：66．0，45．0，36．0，29．0，24．0，20．1，14．2kDa，respectively）；2：pET30a－DEN2product；3：pET30acontrol

2．3 重組蛋白應(yīng)用于檢測登革2型IgG抗體 以純化重組抗原100ng／孔包被板條，用間接ELISA法檢測46份登革2型感染者血清、31份正常人血清和8份日本腦炎IgG陽性的人血清。46份患者血清中檢出44份陽性，31份正常人血清中檢出1例陽性，8份日本腦炎IgG陽性血清結(jié)果全為陰性。以IFTA為參照標(biāo)準(zhǔn)，重組抗原檢測登革2型IgG抗體的敏感性為95．6%，特異性為96．8%。用重組抗原和澳大利亞Panbio IgG捕獲法ELISA試劑盒同時對77份登革2型可疑感染者血清進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。χ2檢驗(yàn)顯示兩種方法對登革2型IgG的檢出率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

表1 重組抗原與Panbio試劑盒對77份登革2型可疑感染者血清IgG檢測結(jié)果的比較Tab．1 Comparison of detecting DEN2IgG in 77sera by indirect ELISA with recombinant protein and Panbio Dengue IgG capture ELISA

3 討 論

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，是登革熱的病原體。其基因組編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM／M、E）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1－5）。其中E蛋白在病毒吸附宿主細(xì)胞，pH介導(dǎo)或抗體特異性膜融合促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞、病毒組裝以及誘導(dǎo)保護(hù)性免疫和病毒中和抗體中起著重要的作用［4－6］。因此E蛋白成為組裝檢測試劑盒和亞單位候選疫苗的常用抗原。國內(nèi)外學(xué)者分別運(yùn)用不同的載體、不同的表達(dá)系統(tǒng)對全長E基因進(jìn)行了表達(dá)。Kelly［7］等人應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)登革2型全長E蛋白，并證實(shí)其免疫原性。魏惠永［8］在畢赤酵母細(xì)胞中成功表達(dá)登革2型全長E蛋白，并保留其免疫反應(yīng)性。但是全長的E蛋白大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)量較低，不利于重組蛋白的純化及研究應(yīng)用。

通過對E基因序列的分析表明，E蛋白C端100個氨基酸為疏水區(qū)，因此選擇基因片段進(jìn)行重組蛋白表達(dá)應(yīng)避開此區(qū)域。研究表明，去除C端疏水區(qū)可以提高E蛋白的表達(dá)量。Sugrue［9］分別用大腸桿菌和畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)登革1型全長E蛋白，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)的全長E蛋白易降解，但是去除C端疏水區(qū)后產(chǎn)量提高至100μg／L而且不會降解。Chiu［10］等用大腸桿菌表達(dá)登革2型去除C端疏水區(qū)的E蛋白，重組蛋白可以抑制2型病毒感染BHK細(xì)胞時空斑的形成。本文采用大腸桿菌表達(dá)登革2型N端80%的E蛋白，純化后應(yīng)用于登革2型IgG抗體的檢測，其靈敏度為95．6%，特異性達(dá)到96．8%，與同是黃病毒科黃病毒屬的日本腦炎病毒之間無交叉反應(yīng)。與Panbio試劑相比，本研究獲得的重組蛋白具有相似的敏感性和特異性。Panbio公司生產(chǎn)的登革檢測試劑盒是目前世界上公認(rèn)敏感性和特異性較好的試劑盒，其采用的重組抗原為昆蟲細(xì)胞表達(dá)的N端80%的E蛋白［11］。由于本研究研制的重組抗原采用原核表達(dá)系統(tǒng)，大大降低了成本，具有潛在的應(yīng)用前景，同時也為研究其它型別的抗原提供了依據(jù)。但是對于研制的2型重組抗原是否具有型別特異性，與其它型別的登革病毒抗體是否有交叉反應(yīng)，有待于收集其它型別的血清進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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