羅鵬飛，曹 尚，李 偉，李 亮，吳 斌，秦圓方，鄧 斐，崔侖標(biāo)，焦永軍，祁 賢，衛(wèi)平民

因?yàn)榭乖疲仔虷3N2變異株每隔2～8年形成一次新的流行，東亞和東南亞地區(qū)位于全球季節(jié)性H3N2流感病毒傳播網(wǎng)絡(luò)的中心位置［1］，該地區(qū)的流感毒株基因變異對(duì)于全球流感流行株的發(fā)展具有預(yù)警作用。

江蘇省2004－2008年間的優(yōu)勢(shì)流行株依次為H3N2亞型、乙型 Victoria系、H3N2亞型、乙型Yamagata系［2］。自2009年4月爆發(fā)以來，豬源性甲型H1N1成為人群中優(yōu)勢(shì)流感流行株，在此期間甲型H3N2流感病毒的流行情況和基因特征極少被關(guān)注。為探討豬源性甲型流感大流行后季節(jié)性H3N2病毒的基因特征，尤其是病毒表面蛋白（血凝素和神經(jīng)氨酸酶）基因的變異情況，特對(duì)在南京市2010年早期監(jiān)測(cè)的3株季節(jié)性H3N2流感病毒的全縣同組測(cè)序，分析毒株基因片段的遺傳特性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 2010年9月，從江蘇省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)上報(bào)的3例南京地區(qū)H3N2流感病例的咽拭子中分離到流感病毒，并經(jīng)過血凝抑制實(shí)驗(yàn)和流感病毒核酸監(jiān)測(cè)證實(shí)，分別命名為：A／Nanjing／1654／2010（H3N2）、A／Nanjing／1655／2010（H3N2）和 A／Nanjing／1663／2010（H3N2），依次簡(jiǎn)稱為 Nanjing／1654、Nanjing／1655和Nanjing／1663。

1．2 方法

1．2．1 病毒RNA提取 采用德國QIAGEN公司RNeasy Mini Kit試劑盒，按試劑盒說明書中要求，處理病毒液（接種于 MDCK細(xì)胞并經(jīng)5～7d培養(yǎng)），提取病毒RNA。

1．2．2 病毒基因片段的PCR擴(kuò)增 采用INVITROGEN公司的SuperScriptⅡReverse Transcriptase試劑盒將病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用TAKARA公司的TAKARA LA Taq PCR試劑盒擴(kuò)增病毒8個(gè)基因組片段；擴(kuò)增引物及方法詳見Hoffman等建立的流感病毒全基因組擴(kuò)增方法［3］。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定、回收目的條帶并進(jìn)行凝膠DNA純化回收，獲得目的條帶的PCR純化產(chǎn)物。

1．2．3 序列測(cè)定與數(shù)據(jù)分析 將包含目的片段的PCR純化產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序；采用DNAStar軟件中的EditSeq和MegAlign進(jìn)行核苷酸序列拼接和氨基酸殘基推導(dǎo)、比對(duì)，采用BLASTn工具搜索NCBI中同目的片段核苷酸序列相似度最高的核苷酸序列，采用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹；其他甲型H3N2流感分離株的核苷酸、氨基酸序列下載于NCBI數(shù)據(jù)庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）。

2 結(jié) 果

2．1各個(gè)基因核苷酸序列的相似序列 所測(cè)3株病毒RNA片段1→8（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）的核苷酸序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。同季節(jié)性H3N2病毒參考毒株比對(duì)，各片段序列長(zhǎng)度與參考株對(duì)應(yīng)片段相同，不存在核苷酸插入和缺失。24個(gè)目的片段相似度最高的2010年前流感病毒株均為人甲型 H3N2流感病毒，見表1。其中Nanjing／1654的PA 片段與另一分離毒株A／California／VRDL3390／2009（H3N2）的 相 似 度 最 高（99．6%）。

2．2 進(jìn)化特征 分別構(gòu)建38株H3亞型流感病毒片段4和30株N2亞型流感病毒片段6核苷酸序列的進(jìn)化樹（圖1）。整體來看，季節(jié)性H3N2病毒與豬群病毒間的進(jìn)化關(guān)系更近，而與禽或馬源流感片段區(qū)分顯著。兩個(gè)進(jìn)化樹顯示所測(cè)病毒的HA和NA片段都位于季節(jié)性H3N2毒株組成的分支，其中Nanjing／1655和Nanjing／1663處在相同的終末 分 支 上，與 日 本 毒 株 A／Niigata／1147／2010（H3N2）相近。

構(gòu)建17株季節(jié)性H3N2病毒和4株豬源H3N2病毒的PB2、PB1、PA、NP、NS和 M 6個(gè)片段核苷酸序列的進(jìn)化樹（圖2），因部分毒株的片段不完整而未引入進(jìn)化樹中。叢書結(jié)構(gòu)上看PB2、PB1、PA、NP、NS和M片段呈現(xiàn)出類似HA基因的進(jìn)化特征，相比豬群毒株，所測(cè)病毒與相近年代疫苗株進(jìn)化距離較近，同 A／Niigata／1147／2010（H3N2）最近。

圖1 基于片段4和6核苷酸序列的不同宿主來源毒株的進(jìn)化樹Fig．1 Phylogenetic trees based on nucleotide sequences of segment 4and 6of isolates from different kinds of host．The phylogenetic trees are generated by neighbor－joining algorithm based on 1 000replicates，H3N2isolates（Nanjing 2010）and vaccine strain（2010－2011）are marked by black bold

圖2 基于片段1，2，3，5，7和8核苷酸序列的H3N2互型毒株的進(jìn)化樹Fig．2 Phylogenetic trees based on nucleotide sequences of segment（1，2，3，5，7，8）of H3N2subtype viruses

2．3 氨基酸序列的位點(diǎn)分析 對(duì)比A／Perth／16／2009的HA蛋白氨基酸序列，3株流感病毒共12個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異（Table 2）。其剪切位點(diǎn)序列為PEKQTR↓G，含一個(gè)堿性氨基酸（R），為低致病性流感病毒特征。HA1蛋白抗原位點(diǎn)變異位于A、C、D和E區(qū)［4］，氨基酸變異數(shù)目分別為3、7和7個(gè)，所測(cè)病毒株兩兩間的抗原位點(diǎn)變異數(shù)分別為4個(gè)（Nanjing／1654和 Nanjing／1655），4個(gè)（Nanjing／1654和 Nanjing／1663）和 2 個(gè) （Nanjing／1655 和Nanjing／1663）。變異未發(fā)生在宿主受體結(jié)合位點(diǎn)（98、153、190、194、183、155、134～138和224～228位）［5］。Nanjing／1654和 A／Perth／16／2009含有10個(gè)糖基化位點(diǎn)（第8、22、38、63、122、126、133、165、246、285位），Nanjing／1655 和 Nanjing／1663 的第124位氨基酸為N，使的第122位的糖基化位點(diǎn)消失。Nanjing／1655的305R不能與281C形成二硫鍵，使得其二硫鍵數(shù)目減少一對(duì)。

對(duì)比 A／Perth／16／2009，3株病毒的 NA 蛋白共發(fā)生10個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異（Table 3）。其中發(fā)生于N2亞型7個(gè)抗原決定簇［6］的變異是第342和402位，變異數(shù)目分別為1、2和1個(gè)。未見NA蛋白的酶活性中心（118R、151D、152R、224R、276E、292R、371R、406Y、119E、156R、178W、179S、198D／N、222I、227E、274H、277E、294N、425E）的耐藥位點(diǎn)變異292（R→K）、119（E→G／A／D／V）、294（N→S）、151（D→E）、276（E→D）［7］。3株 H3N2和 A／Perth／16／2009均包含7個(gè)糖基化位點(diǎn)（第61、69、70、86、146、200、234和329位）。

表2 HA蛋白的氨基酸變異位點(diǎn)Tab．2 Amino acid site variations distribution of HA protein

表3 HA蛋白的氨基酸變異位點(diǎn)Tab．3 All the amino acid site variations of NA protein

在PB2、PB1、PA 3個(gè)基因的宿主特異性保守氨基酸位點(diǎn) PB2（199、475、567、627、702aa）、PB1（375aa）和 PA（55、100、382、552aa）［8］中，所測(cè)病毒PB1蛋白375位氨基酸為G，不同于A／Brisbane／10／2007、A／Nanjing／1／2009以及人群 H3N2中的S。另外，PA第510aa的突變（H→A）可能抑制病毒多聚酶復(fù)合體對(duì)RNA的核酸內(nèi)切作用而降低病毒的轉(zhuǎn)錄活性，所測(cè)病毒PA第510aa均為組氨酸（H）。NP蛋白第16、33、100、136、283、313位氨基酸與宿主特異性有關(guān)，相比A／Brisbane／10／2007和A／Nanjing／1／2009，所測(cè)3株病毒此6個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生變異。

M1蛋白101～105位氨基酸（RKLKR）是M1蛋白的RNA結(jié)合區(qū)和核定位信號(hào)區(qū)，148～162位為一個(gè)潛在的CCHH鋅指結(jié)構(gòu)基序（CATCEQIADSQHRSH），所測(cè)病毒的以上位點(diǎn)上均未變異。M2蛋白為流感病毒的離子通道蛋白，其第37和41aa為離子通道的活性核心部位，金剛烷胺類藥物與活性核心部位結(jié)合后抑制離子通道功能，所測(cè)病毒的第31位氨基酸發(fā)生耐藥性突變（S→N）而引起金剛烷胺耐藥。

NS1蛋白N端（核心序列19～38）為RNA結(jié)合域，C端（核心序列134～161）為效應(yīng)區(qū)，兩個(gè)區(qū)域相 對(duì) 保 守［8］。 相 比 A／Brisbane／10／2007，Nanjing／1654的第157（V→A）位氨基酸發(fā)生變異，Nanjing／1655和Nanjing／1663未發(fā)生變異，它們的PL基序完整，均為RSKV。

PB1－F2蛋白由PB1片段的另外一個(gè)ORF編碼，完整的PB1－F2蛋白為90個(gè)氨基酸。第69～82位氨基酸被認(rèn)為是線粒體靶向序列，與病毒促進(jìn)宿主細(xì) 胞 凋 亡 相 關(guān)［9］。與 A／Brisbane／10／2007、A／Nanjing／1／2009以及 A／Beijing／1／1968相比，所測(cè)病毒的MTS內(nèi)氨基酸未變異，但Nanjing／1655和Nanjing／1663的PB1－F2氨基酸鏈理論上在第26位發(fā)生了斷裂，可能使得蛋白截短為25aa而失去相關(guān)的功能。

3 討 論

江蘇省CDC在2010年9月之前1年多時(shí)間里未監(jiān)測(cè)到南京市H3N2亞型病毒感染的病例，所分離3株病毒的基因特征可在一定程度上解釋南京地區(qū)H3N2亞型病毒的變異情況。一般認(rèn)為具有代表性的甲型流感病毒新變種要存在一定的抗原性差異，并在HA1區(qū)存在4個(gè)以上的氨基酸變異，這些氨基酸的變化還必須涉及2～3個(gè)抗原決定簇［10］。參考2010－2011年H3N2疫苗株，并結(jié)合HA1基因氨基酸變異的數(shù)目和位置，我們推測(cè)，與2009年H1N1流感大流行前的H3N2流感毒株相比，新變種很可能已經(jīng)形成，且毒株Nanjing／1654與另兩株病毒間可能存在抗原漂移，但這還須結(jié)合病毒抗原性檢測(cè)結(jié)果予以證明。另外，流感病毒血凝素蛋白糖基化的主要作用是穩(wěn)定血凝素蛋白結(jié)構(gòu)，防止血凝素蛋白被水解以及阻礙抗體對(duì)病毒的識(shí)別和清除，所測(cè)病毒糖基化位點(diǎn)的增加或減少對(duì)流感病毒的抗原性及其他生物學(xué)特性均有一定影響。大規(guī)模測(cè)序顯示一定范圍內(nèi)的H3N2流感病毒基因特征可表現(xiàn)出一定的差異［11］，呈現(xiàn)不同“亞群”混合流行，根據(jù)本研究中3株病毒HA片段的特征推測(cè)這種分化特征可能形成，這必然會(huì)增加疫苗應(yīng)用的難度。另外，8個(gè)片段的進(jìn)化特征表明分離株Nanjing／1655和 Nanjing／1655與日本流感毒株 A／Niigata／1147／2010在遺傳進(jìn)化上具有很高同源性，推測(cè)這類H3N2病毒可能已經(jīng)形成了跨地區(qū)間的傳播。

當(dāng)前的抗流感病毒藥物主要包括M2離子通道阻斷劑（金剛烷胺和金剛乙胺）和神經(jīng)氨酸酶抑制劑（扎那米韋和奧司他韋）。金剛烷胺和金剛乙胺通過阻斷M2離子通道蛋白阻止病毒脫殼，使病毒RNA不能釋放到細(xì)胞質(zhì)中，病毒的早期復(fù)制被中斷，從而起到抗流感病毒的作用；扎那米韋和奧司他韋特異性抑制A、B型流感病毒的NA。1994～1995年的H3N2流感毒株對(duì) M2阻斷劑耐藥率約0．4%，但2003年后約61%的亞洲季節(jié)性H3N2流感毒株耐藥，且耐藥率還在上升［12］。本研究中H3N2病毒普遍對(duì)M2阻斷劑耐藥，而對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感，因此對(duì)當(dāng)前H3N2流感的抗病毒治療應(yīng)使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物代替金剛烷胺和金剛乙胺，但嚴(yán)格管理其使用范圍和劑量，以防止NA耐藥毒株的快速產(chǎn)生。

面對(duì)宿主的免疫選擇作用，病毒部分基因突變會(huì)被保存下來，成為病毒進(jìn)化過程中的重要標(biāo)志，發(fā)生在PB1（375位）和 PB1－F2（26位）的變異可能是病毒進(jìn)化過程的重要分子標(biāo)志。尤其PB1－F2蛋白于2001年被發(fā)現(xiàn)，完整的PB1－F2在病毒感染宿主的過程中具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡等重要功能。不同宿主、不同亞型病毒的PB1－F2呈現(xiàn)不同的斷裂特征，H1N1亞型病毒的PB1－F2蛋白斷裂較普遍，如季節(jié)性H1N1病毒在其第57位后發(fā)生斷裂，古典豬H1N1病毒在其第11、25和34位后發(fā)生斷裂，2009年新甲型H1N1流感病毒代表株A／California／07／2009（H1N1）在其第11、57和87aa后發(fā)生斷裂，而大多數(shù)季節(jié)性H3N2病毒的PB1－F2是完整的，只有少部分地區(qū)曾報(bào)道人群H3N2病毒株P(guān)B1－F2蛋白的斷裂［9］，本次研究也首次發(fā)現(xiàn)了中國大陸地區(qū)的PB1－F2蛋白斷裂。

從進(jìn)化關(guān)系上講，相比禽源流感病毒，豬群H3N2病毒同人群病毒具有相近的基因相似度。根據(jù)2005－2008年間的國內(nèi)的豬群H3N2病毒和本次分離毒株間的遺傳關(guān)系，此次本地區(qū)重新出現(xiàn)的甲型H3N2病毒很可能在人群中隱性感染而不斷進(jìn)化后發(fā)?。涣硪环矫?，人和禽甲型H3N2病毒可以分別與其結(jié)合而直接傳染給豬，又因?yàn)镹CBI數(shù)據(jù)庫中暫時(shí)沒有收集到中國地區(qū)2008年以后的豬流感H3N2病毒的序列信息，同時(shí)期的豬源病毒遺傳信息未知，也不排除在豬群中進(jìn)化后傳播給人。華東地區(qū)傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖模式為季節(jié)性流感病毒的進(jìn)化提供了復(fù)雜的宿主結(jié)構(gòu)，這也使得H3N2病毒的監(jiān)測(cè)和防治工作變得更加復(fù)雜。江蘇省2005年發(fā)現(xiàn)的“三源重配”豬H3N2流感病毒等［13］讓我們更加準(zhǔn)確地掌握了流感病毒在豬群中的進(jìn)化特征，加強(qiáng)流感病毒在動(dòng)物宿主中的監(jiān)測(cè)，從生態(tài)學(xué)角度綜合防治成為了本地區(qū)流感防控的新方向。

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