湯 敏，官春云，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙410128)

油菜是重要的油料作物，在20世紀70年代前油菜的遺傳改良都是通過雜交、誘變等傳統(tǒng)育種方法來實現(xiàn)的。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是基因重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，為油菜的遺傳改良開辟了新的路徑。20余年來油菜轉(zhuǎn)基因研究得到了迅速發(fā)展，但遺傳轉(zhuǎn)化的效率品種之間差異大［1］，轉(zhuǎn)化頻率普遍偏低，限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的普遍利用，影響油菜育種水平的提高和新基因的功能快速分析鑒定。因此，提高轉(zhuǎn)化效率是油菜轉(zhuǎn)基因研究的關(guān)鍵所在。

迄今為止植物轉(zhuǎn)基因方法主要分為兩大類，一是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，二是外源基因直接轉(zhuǎn)化法。

1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

在轉(zhuǎn)基因方法上，盡管有用PEG法和激光微束法等獲得轉(zhuǎn)基因植株的報道，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)法仍然是油菜轉(zhuǎn)基因研究的首選方法。對于油菜來說，子葉柄和下胚軸因其非常易于再生而被視為最理想的轉(zhuǎn)化受體。其再生方式一般是誘導(dǎo)脫分化產(chǎn)生愈傷組織再分化成芽，主要包括種子萌發(fā)，預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)之后，先誘導(dǎo)愈傷組織，再進行芽的分化和生根培養(yǎng)等步驟。

(1)種子萌發(fā)。先將種子用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗 2遍，再用0.1%HgCl2浸泡 15 min，無菌水沖洗5遍，晾干。接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，25℃下暗培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)2 d。(2)預(yù)培養(yǎng)。用解剖刀切下下胚軸(7～10 mm)，將切下的外植體置于預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3 d。(3)共培養(yǎng)。將下胚軸置于農(nóng)桿菌菌液中浸泡4～5 min，用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將外植體接種至共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 d。(4)誘導(dǎo)愈傷。將經(jīng)過共培養(yǎng)的下胚軸平放于不含篩選劑培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷及分化，一般培養(yǎng)7～10 d。(5)芽分化。10～15 d左右轉(zhuǎn)接到相同的含篩選劑的篩選分化培養(yǎng)基中。(6)當分化的不定芽長到2～3 cm時，自芽基部切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

1.1 萌發(fā)培養(yǎng)

萌發(fā)培養(yǎng)基大多采用全量、半量或1/4 MS培養(yǎng)基，也有采用B5培養(yǎng)基的。佘小玲和李栒［2］以甘藍型油菜雙低品種湘油13號為材料，發(fā)現(xiàn)在萌發(fā)培養(yǎng)基中加入2 mg/L 6－BA和0.15 mg/L NAA有利于下胚軸形成愈傷組織，從而提高愈傷組織的芽苗分化頻率。而歐陽麗瑩等［3］以4個甘藍型黃籽油菜品種為材料，發(fā)現(xiàn)在萌發(fā)培養(yǎng)基中添加6－BA和NAA對下胚軸的再生無明顯影響，而來源于含生長調(diào)節(jié)劑的萌發(fā)培養(yǎng)基的下胚軸，其再生苗不僅矮小，而且轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后節(jié)間不能伸長。不同品種萌發(fā)日齡要求不同。王艷等［4］發(fā)現(xiàn)，以5 d苗齡的下胚軸為外植體最有利于芽的分化，其下胚軸再生頻率為35.00%，當苗齡9 d時，再生頻率明顯下降，僅有19.44%。劉曉慶等［5］認為，以6～8 d幼苗的下胚軸為外植體有利于芽的分化，7 d苗齡的甘藍型油菜下胚軸再生頻率可達35.83%，當苗齡為5 d和9 d時，再生頻率分別只有17.65%和19.17%。Cardoza 和 Stewart［6］報道，以8 d 苗齡的下胚軸為外植體進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化頻率可達17% ～25%。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，芥菜型油菜四川黃籽自交系黑暗培養(yǎng)4 d再光照培養(yǎng)2 d的下胚軸長得綠而壯，有利于后期愈傷組織的形成，且農(nóng)桿菌浸染后不易褐化。而對于子葉柄則直接光照培養(yǎng)5 d或者先黑暗培養(yǎng)2 d再光照培養(yǎng)3 d，且未長出真葉前有利于分化再生。

1.2 預(yù)培養(yǎng)

轉(zhuǎn)化受體和農(nóng)桿菌的生理狀態(tài)是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的兩個關(guān)鍵因素。預(yù)培養(yǎng)可以促進細胞分裂，分裂狀態(tài)的細胞更容易整合外源DNA，使轉(zhuǎn)化頻率升高，并能在一定程度上減輕褐化程度［7］。2，4－D對誘導(dǎo)油菜愈傷組織是必需的，且能提高愈傷組織的分化率、質(zhì)量和時間［8］。Maheshwari等［9］以下胚軸為外植體比較了NAA、IAA、2，4－D和6－BA不同濃度組合對誘導(dǎo)愈傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨使用2，4－D且濃度為1 mg/L時愈傷率最高為100%。Ali等［10］報道使用0.5 mg/L 2，4 －D 與0.5 mg/L 6－BA組合誘導(dǎo)愈傷率達95% ～96%。預(yù)培養(yǎng)時間的長短對細胞正常分化也有很大影響。預(yù)培養(yǎng)時間過長，整塊切段形成松散型的愈傷組織，這類愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上大多變褐死亡。Cardoza等［11］在以下胚軸為外植體進行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)時間72 h比預(yù)培養(yǎng)24 h和48 h的轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化率達25%。Khan等［12］研究發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)72 h農(nóng)桿菌感染最有效，GUS活性檢測達到80%。Zhang等［13］報道，以下胚軸為外植體，預(yù)培養(yǎng)72 h可減輕褐化現(xiàn)象，芽再生頻率可從35.56%提高至57.78%，大大提高轉(zhuǎn)化效率。

1.3 農(nóng)桿菌感染濃度和時間

農(nóng)桿菌感染濃度和時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化的另一個重要因素。菌液濃度過高或偏低，感染時間過長或不足，不是導(dǎo)致受體被農(nóng)桿菌浸染過度致死，就是受體細胞未被感染。王景雪等［14］發(fā)現(xiàn)，以根癌農(nóng)桿菌LBA4404感染下胚軸，較低的菌液濃度(OD600=0.2～0.4)浸染5 min可以減輕外植體的褐化，有利于外植體的愈傷組織生長和抗性芽苗的分化，當菌液OD600=0.2時，下胚軸抗性苗分化率高達14.44%。張 承 妹［15］等 認 為，以 根 癌 農(nóng) 桿 菌LBA4404感染子葉柄，菌液濃度以對數(shù)分裂中期(OD600=0.7)為佳，此時農(nóng)桿菌浸染能力最強，外源基因容易整合進去。周小梅等［16］以根癌農(nóng)桿菌EHA105感染子葉柄時發(fā)現(xiàn)，感染時間為10 min時分化率最高，可達到24.3%，感染時間超過15 min時導(dǎo)致褐化，并且時間越長褐化越嚴重，在以后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基時，根不易分化而且常攜帶菌，難以抑制、清除。不同菌株對同一植物的轉(zhuǎn)化效率存在差異。高武軍等［17］研究發(fā)現(xiàn)，胭脂堿型菌株對于油菜的轉(zhuǎn)化要優(yōu)于章魚堿型菌株。

1.4 共培養(yǎng)

農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16 h之后的菌體才能誘發(fā)腫瘤，這一段時間稱為“細胞調(diào)節(jié)期”。因此，共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率有很大影響，而且不同的物種和受體材料，農(nóng)桿菌的最佳共培養(yǎng)時間不同。Khan［12］報道，共培養(yǎng)時間為3 d轉(zhuǎn)化效率最高，共培養(yǎng)時間超過3 d，誘發(fā)農(nóng)桿菌過度生長，外植體將受到過度感染，褐化和軟腐現(xiàn)象嚴重，再生困難，且后繼培養(yǎng)中抑菌困難，轉(zhuǎn)化率大大降低。Bhuiyan等［18］則發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)時間為2 d轉(zhuǎn)化效率最好。Zhang［19］研究報道，共培養(yǎng)溫度在25℃時抗性愈傷率最高，采用濾紙共培法即將外植體置于鋪有一張滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以防止農(nóng)桿菌因直接接觸培養(yǎng)基引起過度生長、蔓延而造成對外植體的過度浸染，減少褐化。

1.5 脫分化和分化培養(yǎng)基

脫分化和分化培養(yǎng)基一般采用全量MS培養(yǎng)基，并添加6－BA、NAA、抑菌劑、篩選劑和 AgNO3。6－BA對細胞的再分化有決定性作用，對芽的正常發(fā)育也有很大影響。在脫分化和分化培養(yǎng)基中，高濃度的6－BA與低濃度的NAA以及適量的AgNO3配合使用，能夠促進油菜子葉和下胚軸的分化出芽。Kamal等［20］報道，在含 3 mg/L ABA、1 mg/L NAA、8 mg/L BAP的培養(yǎng)基中子葉柄的苗再生率可達100%。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，以芥菜型油菜四川黃籽下胚軸為外植體進行轉(zhuǎn)化時，分化培養(yǎng)基中一旦添加NAA，下胚軸所形成的愈傷在最初的器官分化中就會產(chǎn)生大量的毛狀根，其芽的再生頻率也顯著下降。

共培養(yǎng)后，外植體表面和內(nèi)部殘留的農(nóng)桿菌非常容易引起污染，從而影響不定芽再生。油菜遺傳轉(zhuǎn)化中一般采用羧芐青霉素和頭孢霉素等抑菌劑來抑制農(nóng)桿菌的繁殖。有研究認為頭孢霉素能夠增加玻璃化和芽的腐爛壞死，而羧芐青霉素高濃度(500 mg/L)時，不僅可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長，而且可以減少AgNO3的不利作用［21］，有利于芽分化。但羧芐青霉素對生根不利。Khan［12］研究表明，在子葉柄和下胚軸的組織培養(yǎng)中添加AgNO3可明顯提高芽再生頻率，促進芽提早分化，但是濃度超過5 mg/L時容易引起玻璃化苗和組織腐爛壞死。AgNO3使用的最佳時間是共培養(yǎng)后對外植體開始進行選擇時。

1.6 生根培養(yǎng)

生根多采用全量或半量MS培養(yǎng)基，添加或不添加NAA或 IBA。Cardoza等［11］采用1/2MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L IBA，將蔗糖濃度由30 g/L降到10 g/L，一周后便能誘導(dǎo)不定芽生根，且生根率可達100%，而采用MS附加0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基發(fā)根遲，且生根率只有25%。但 Maheshwari等［9］發(fā)現(xiàn)，采用不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)12～13 d后便可以誘導(dǎo)生根，且生根率可達100%。生根培養(yǎng)基中一般加Kan進行根選，獲得的轉(zhuǎn)基因植株再進行PCR和大田檢測。

2 浸花轉(zhuǎn)化方法

浸花法(floral－dip)已成為擬南芥廣泛采用的In Planta轉(zhuǎn)基因方法，也成功應(yīng)用于油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中。徐光碩等［22］用根癌農(nóng)桿菌懸浮液直接浸染油菜花序，比較5個甘藍型油菜供試品種的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果表明無明顯差異，轉(zhuǎn)化效率達0.1%。付紹紅等［23］運用改進的浸花法將構(gòu)建的PEPC基因ihpRNA干擾表達載體轉(zhuǎn)移到甘藍型油菜中，對Westar和F008兩個轉(zhuǎn)化材料分別處理了20個單株，獲得平均轉(zhuǎn)化效率為0.69%。

2.1 浸花轉(zhuǎn)化方法

Bechtold等［24］發(fā)明了真空滲入法，將擬南芥即將開花的植株浸入農(nóng)桿菌菌液，然后用真空泵抽真空再恢復(fù)常壓，再置于正常條件下生長，得到大量T－DNA插入突變體。Clough和 Bent［25］在真空滲入法的基礎(chǔ)上又在擬南芥中發(fā)展了浸花轉(zhuǎn)化方法。該法無需進行真空處理，而是在農(nóng)桿菌浸染液中加入了表面活性物質(zhì)SilwetL－77，然后浸染擬南芥花序，最后收獲的轉(zhuǎn)基因種子占所有種子的0.5%。Chung等［26］用農(nóng)桿菌菌液對擬南芥花序浸染或噴霧，同樣獲得了與真空滲入浸染相當?shù)霓D(zhuǎn)化效率。

Ye等［27］用真空處理花序后按時間順序做了一系列GUS活性的瞬間表達，發(fā)現(xiàn)3～5 d后能在花序上觀察到染色，而在植株其他部位很少，5～11 d后能在子房中觀察到染色，染色部位在珠孔區(qū)。這說明用浸花法轉(zhuǎn)化時，外源基因整合的部位是卵細胞。Desfeux［28］采用不同啟動子與GUS基因連接，研究在農(nóng)桿菌處理后，不同組織部位的染色情況。結(jié)果表明，浸花法轉(zhuǎn)化中直接有效的部位為植物的胚珠，而在浸漬后的花粉中未見任何染色。

和傳統(tǒng)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，浸花法避免了組織培養(yǎng)階段，排除了組織培養(yǎng)中因體細胞變異導(dǎo)致的目的基因的不正確表達，造成分子遺傳學(xué)研究中不利的遺傳背景，是一種避免了植物組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法。其突出的優(yōu)點是操作簡單、快捷，節(jié)省時間，在一般實驗室或大田即可進行;轉(zhuǎn)化率高，易重復(fù);由轉(zhuǎn)化受體直接可得到種子，長成植株，避開了由體細胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的難關(guān)以及試管苗移栽不易成活的麻煩。

浸花法只需在油菜盛花期前選擇即將開花的分枝，剪去分枝上已經(jīng)開放的花。然后將準備好的OD600=0.6～0.8農(nóng)桿菌菌液離心用MS液重懸，加入5%蔗糖和0.05%的SilwetL－77，將枝條彎曲，使整個花序泡在盛有菌液的燒杯中，上下?lián)u動1 min左右。在確保所有花都已被浸染后，用硫酸鈉紙袋將處理過的花序套住。于終花期將花序上的紙袋取下，管理好植株。待種子成熟時，將處理過的分枝剪下單獨收獲種子，曬干后脫粒儲藏。

2.2 浸花法的影響因素

在擬南芥上的研究表明，浸花法的轉(zhuǎn)化效率受植株發(fā)育時期、滲透劑濃度和滲透介質(zhì)等多種因素的影響。付紹紅等［29］研究了浸染次數(shù)對轉(zhuǎn)化頻率的影響，采用同一濃度的表面活性劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 d內(nèi)每隔1 d進行連續(xù)3次浸漬處理轉(zhuǎn)化頻率優(yōu)于1、2次處理。王道杰等［30］以不同遺傳背景的3個甘藍型油菜品種(系)陜3B、L45和Mg23為材料，對真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化方法中真空滲透時間和Silwet L－77濃度與遺傳轉(zhuǎn)化效果的關(guān)系進行了比較，結(jié)果表明在0% ～0.05%的濃度范圍內(nèi)，在相同的真空滲透時間內(nèi)，隨著Silwet L－77濃度的增加，3個油菜品種的轉(zhuǎn)化率逐漸升高。當Silwet L－77濃度為0.05%時，10 min的真空滲透時間可獲得最高轉(zhuǎn)化效率。在浸染液中加入5%蔗糖和10 mg/L的6－BA也可提高轉(zhuǎn)化效率。

3 存在問題與展望

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜轉(zhuǎn)化中，不同基因型品種、不同類型的外植體的分化頻率差異較大，油菜基因轉(zhuǎn)化頻率低，轉(zhuǎn)化技術(shù)體系重復(fù)性差。已經(jīng)建立的油菜轉(zhuǎn)化體系主要集中在甘藍型油菜，對于芥菜型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化少有報道，且其轉(zhuǎn)化率相對于甘藍型油菜的要低。在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中，外源基因插入植物基因組基本上是隨機的，而且其表達水平、表達部位及表達時間也大多不受控制。獲得的轉(zhuǎn)基因植物能否保持外源基因的穩(wěn)定性，即能否穩(wěn)定地遺傳給下一代，直接關(guān)系到基因工程新品種的培育。因此，利用組織化學(xué)和分子生物學(xué)等多種手段來探索農(nóng)桿菌與植物細胞互作，以及植物轉(zhuǎn)化細胞再生的分子機制，以便從根本上提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化率還有待進一步研究。同時，轉(zhuǎn)基因油菜研究只有與傳統(tǒng)常規(guī)育種相結(jié)合才能真正實現(xiàn)其社會意義。

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