郭龍江 吳雅清

華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所 分子藥物教育部工程研究中心， 福建泉州 362021

腫瘤基因靶向治療中的啟動(dòng)子研究

郭龍江 吳雅清

華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所 分子藥物教育部工程研究中心， 福建泉州 362021

利用腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控治療基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性基因治療以及提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重要手段和有效途徑。腫瘤特異性啟動(dòng)子可耦聯(lián)溶瘤基因、抑癌基因、自殺基因以及siRNA/MicRNA等，特異性調(diào)控這些基因在腫瘤治療中殺死或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，或抑制其生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞影響非常小，從而達(dá)到特異性治療的目的。

基因治療；腫瘤；特異性啟動(dòng)子；靶向治療

研究證明，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的靶向性、突變基因的原位修復(fù)、基因表達(dá)的時(shí)相性、基因表達(dá)的靶向性等調(diào)控手段，可解決基因治療的靶向性和安全性不足的問(wèn)題[1]。腫瘤特異性啟動(dòng)子（tumor specific promoter，TSP）可特異地調(diào)控靶基因在癌細(xì)胞中表達(dá)，增強(qiáng)靶基因的表達(dá)效率和特異性，從而提高癌基因治療的靶向性和安全性。

1 啟動(dòng)子的概念及研究意義

運(yùn)用特定的基因表達(dá)調(diào)控元件，使目的基因特異地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而避免對(duì)正常細(xì)胞的損傷，是實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療靶向性的重要手段之一[2]。啟動(dòng)子是遺傳區(qū)域的上游調(diào)控單元，每個(gè)基因在5’磷酸末端具有一個(gè)啟動(dòng)序列作為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它是結(jié)合RNA聚合酶啟動(dòng)mRNA轉(zhuǎn)錄的重要條件之一。研究表明，啟動(dòng)子需要由特定的轉(zhuǎn)錄因子激活才能具有活性，啟動(dòng)子具有組織特異性調(diào)控功能。pGL6-Basic為無(wú)啟動(dòng)子的含有蟲(chóng)熒光素酶（luciferase，Luc）報(bào)告基因的質(zhì)粒，pRL-tk為含有tk啟動(dòng)子調(diào)控的海洋腔腸熒光素酶（Renillaluciferase，RL）報(bào)告基因的質(zhì)粒，在pGL6-Basic基礎(chǔ)上重組目的啟動(dòng)子序列后，與pRL-tk共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，然后用雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中Luc和RL活性，后者的活性反映每孔細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，Luc/RL的比值則可反映目的啟動(dòng)子的相對(duì)活性。

2 腫瘤特異啟動(dòng)子

2.1 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）

hTERT蛋白在90%以上的腫瘤組織中表達(dá)升高，而在正常組織中卻很難檢測(cè)到，與其他啟動(dòng)子相比，hTERT更具廣譜性和安全性。端粒酶在幾乎所有的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中具有高活性，因此很早就有研究者用hTERT啟動(dòng)子取代控制腺病毒復(fù)制必需基因E1A的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控病毒在體內(nèi)特異性復(fù)制，從而達(dá)到靶向治療的目的[3]。最近Crystal等[4]利用hTERT啟動(dòng)子偶聯(lián)吲哚-3-甲醇的端粒酶基因阻滯人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞的G1期細(xì)胞周期。Jessica等[5]利用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控新型腺病毒裝載的GFP-TRAIL融合蛋白表達(dá)，靶向不同人類(lèi)腦膜瘤和膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從而起到了靶向治療的效果。

2.2 凋亡抑制蛋白（survivin）

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的成員，同樣在眾多腫瘤檢測(cè)到高表達(dá)。Yuh-Pyng等利用survivin啟動(dòng)子調(diào)節(jié)BikDD基因靶向抑制了原位肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存期，實(shí)驗(yàn)證明這一方案是高效且安全的，具有肺癌臨床治療前景。

2.3 甲胎蛋白啟動(dòng)子（alpha-fetoprotein，AFP）

AFP是腫瘤標(biāo)志物，正常時(shí)由卵黃囊及胚胎肝產(chǎn)生，出生1年后維持低水平，肝病時(shí)升高，明顯增高見(jiàn)于肝細(xì)胞性肝癌和畸胎瘤，70%的肝癌患者血清中此種蛋白質(zhì)的水平升高。利用AFP啟動(dòng)子介導(dǎo)tBid協(xié)同化療藥物（5-氟脲嘧啶）對(duì)小鼠原位肝腫瘤模型進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ad/AFPtBid能夠抑制Hep3B腫瘤生長(zhǎng)，而與5-氟脲嘧啶聯(lián)合用藥則效果更加明顯[6]。同時(shí)Cao等[7]利用AFP啟動(dòng)子與E1A啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控?cái)y帶TRAIL基因的溶瘤腺病毒表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)肝癌基因靶向治療，從而證明AFP在癌基因治療中特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用前景。

2.4 神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）

NSE是烯醇化酶的一種同功酶，目前，NSE被公認(rèn)為人小細(xì)胞肺癌（human small cell lung carcinoma cells，SCLC）的最有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物之一[8]。Xu等分別對(duì)不同長(zhǎng)度NSE啟動(dòng)子在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中活性進(jìn)行定量研究，發(fā)現(xiàn)1.8 kb的NSE具有最高活性。應(yīng)用HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)，Tanaka等證明了NSE啟動(dòng)子在人小細(xì)胞肺癌具有高調(diào)控活性，利用單純皰疹病毒Ⅰ型胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-TK）基因/丙氧鳥(niǎo)（GCV）系統(tǒng)，其通過(guò)調(diào)節(jié)單純皰疹病毒胸苷激酶表達(dá)將抗病毒核酸類(lèi)似物前藥GCV磷酸化，從而抑制DNA合成、導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.5 骨鈣素（osteocalcin，OC）

OC是一種由成骨細(xì)胞合成的非膠原蛋白，文獻(xiàn)證明在原發(fā)性骨肉瘤、軟骨肉瘤中廣泛表達(dá)。Johnson等[9]報(bào)道OC啟動(dòng)子通過(guò)維生素C和D3協(xié)同作用誘導(dǎo)，可以靶向不同類(lèi)型的腎細(xì)胞癌基因治療。Shirakawa T等報(bào)道OC啟動(dòng)子和PSA啟動(dòng)子在雄性激素陰性和陽(yáng)性前列腺癌細(xì)胞中均具有高活性，能夠調(diào)控毒性基因殺死前列腺癌細(xì)胞。

2.6 其他

深入地研究腫瘤特異啟動(dòng)子，越來(lái)越多的腫瘤特異性標(biāo)志物基因啟動(dòng)子被證明具有特異性及高效性。癌胚抗原（CEA）啟動(dòng)子可控制或增強(qiáng)融合自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSVTK）在CEA陽(yáng)性癌細(xì)胞中的專(zhuān)一性表達(dá)和殺傷作用[10]；insulinoma associated 1（INSM1）是一類(lèi)含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，INSM1啟動(dòng)子可靶向小細(xì)胞肺癌[11]；毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白（ataxia telang-iectasia mutated，ATM）是一種激酶，Palmieri等[12]報(bào)道高遷移率族蛋白A可促進(jìn)ATM啟動(dòng)子活性，從而達(dá)到高效特異啟動(dòng)子的目的。此外還有環(huán)氧合酶（Cox-2）、分泌白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（SLPI）、轉(zhuǎn)錄因子家族成員E2F啟動(dòng)子等都是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤特異性啟動(dòng)子[13]。

3 腫瘤啟動(dòng)子優(yōu)化及應(yīng)用

3.1 啟動(dòng)子優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性啟動(dòng)子仍然存在著許多不足，例如某些啟動(dòng)子雖然具備特異性，但活性太低，而某些啟動(dòng)子雖然活性高卻是廣譜的，缺乏安全性，所以需要對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化和改造，提高其使用價(jià)值。啟動(dòng)子核酸序列的長(zhǎng)短是優(yōu)化手段之一，活性越高，堿基長(zhǎng)度越短的啟動(dòng)子更具使用價(jià)值，Xu等研究NSE啟動(dòng)子時(shí)，發(fā)現(xiàn)NSE啟動(dòng)子時(shí)，就NSE不同長(zhǎng)度的序列活性進(jìn)行對(duì)比，最終發(fā)現(xiàn)1.8 kb的NSE具有最高活性。其二在原有啟動(dòng)子序列上增加調(diào)控元件，例如將增強(qiáng)子重組到特異性啟動(dòng)子表達(dá)載體中以增加啟動(dòng)子在腫瘤中的活性[14]。在PSA啟動(dòng)子上添加增強(qiáng)子明顯提高了其調(diào)控的綠色熒光蛋白在前列腺癌中的表達(dá)效率。嵌合啟動(dòng)子是啟動(dòng)子優(yōu)化的重要手段之一，研究表明嵌合啟動(dòng)子能夠彌補(bǔ)單一啟動(dòng)子特異性及安全性方面的不足。hTERT啟動(dòng)子和缺氧敏感的缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）啟動(dòng)子嵌合，可調(diào)控裝載有SEA基因的腺病毒靶向治療膀胱癌[15]。Takuya等提出TTS啟動(dòng)子系統(tǒng)，將hTERT啟動(dòng)子和人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白（human surfactant protein A1）嵌合，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于別的癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞，TTS在肺癌中具有明顯的高效性及特異性。隨后Takuya在原有的TTS系統(tǒng)上插入Bid構(gòu)建TTS/Bid系統(tǒng)，證明了TTS對(duì)癌細(xì)胞的具有明顯的殺傷效應(yīng)[16]。IGF2-P4啟動(dòng)子和H19啟動(dòng)子組合在癌細(xì)胞中也表現(xiàn)出高活性，隨后作者又證明了IGF2-P3和IGF2-P4啟動(dòng)子組合具有膀胱癌特異性[17-18]。借助放射線照射、腫瘤局部的缺氧、四環(huán)素等一些外在因素也可以優(yōu)化啟動(dòng)子，提高其活性。

3.2 啟動(dòng)子的應(yīng)用

抗腫瘤效應(yīng)則是由病毒復(fù)制產(chǎn)生，因此復(fù)制必須在腫瘤細(xì)胞，以保護(hù)正常細(xì)胞不被損壞。腫瘤特異性啟動(dòng)子是一種高效的工具用于減少腫瘤基因治療中對(duì)正常組織的損害，已有眾多研究將啟動(dòng)子用于特異性突變或者遞送前藥酶基因的表達(dá)調(diào)控，并取得了很好的效果。Udono等[19]利用特異性啟動(dòng)子hTERT構(gòu)建了腫瘤特異性條件復(fù)制病毒表達(dá)系統(tǒng)，用于癌癥靶向治療。腫瘤特異性啟動(dòng)子可用于遞送前藥酶，如HER-2啟動(dòng)子可調(diào)控HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)殺傷前列腺癌細(xì)胞[20]。通過(guò)RNAi技術(shù)調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)可制定出一系列有效的抗癌策略，應(yīng)用腫瘤特異性啟動(dòng)子如HRAS啟動(dòng)子引導(dǎo)針對(duì)某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或短發(fā)夾（shRNA）表達(dá)，從而達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[21]。將啟動(dòng)子構(gòu)建到攜帶有治療基因如細(xì)菌毒素基因、用于基因治療的細(xì)胞因子、凋亡基因TRAIL等的載體上，直接調(diào)控治療基因的表達(dá)是啟動(dòng)子應(yīng)用最直接的方法。

腫瘤特異性啟動(dòng)子研究，為腫瘤基因治療效率及安全性問(wèn)題開(kāi)辟了一個(gè)新的有效研發(fā)途徑，但是腫瘤特異性啟動(dòng)子仍然存在著許多不足，特異性和高效性尚未得到徹底的解決，人工啟動(dòng)子是否具有潛在危險(xiǎn)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，啟動(dòng)子的優(yōu)化和修飾比較繁瑣，技術(shù)條件要求高，迄今為止還沒(méi)有一個(gè)行之有效的方案供人們參考，目前的方案還有待完善。在腫瘤特異性啟動(dòng)子研究中需要尋找新的效果更為顯著腫瘤特異性啟動(dòng)子，探索更有效的啟動(dòng)優(yōu)化方案及更有臨床前景的啟動(dòng)子應(yīng)用方法。

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Study on specific promoters for tumor target gene therapy

GUO Longjiang WU Yaqing
Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education,Quanzhou 362021,China

By using the tumor specific promoter to regulate related gene expression at tumor cell is one of the best approaches to achieve tumor targeting gene therapy and improve transduction efficiency.TSP could be coupled with oncolytic,tumor suppressor genes,antisense nucleic acids,suicide gene and siRNA/ MicRMA etc,then specific regulate them to induce the apoptosis of tumor cells, kill them directly,or inhibit their proliferation without toxicity to normal cells.

Gene therapy;Tumor;Specific promoters;Targeted therapy

R730.5

A

2095-0616（2012）05-49-03

2012-03-01）