胡天楠，王啟聞，金 雪，胡奇達(dá)，王訓(xùn)師，徐 桑，周 峻，湯谷平

聚乙烯亞胺/環(huán)糊精聚合物偶合雷公藤內(nèi)酯醇的體外抗腫瘤活性研究

胡天楠，王啟聞，金 雪，胡奇達(dá)，王訓(xùn)師，徐 桑，周 峻，湯谷平

(浙江大學(xué)化學(xué)生物和藥物研究所，浙江杭州310028)

目的：合成并表征雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精聚陽(yáng)離子復(fù)合物，考察雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在幾種不同癌細(xì)胞上的抗癌活性和siRNA攜帶能力。方法：通過(guò)N，N'-羰基二咪唑?qū)⒗坠賰?nèi)酯醇偶合到聚乙烯亞胺-環(huán)糊精載體材料上，制成雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精納米復(fù)合物。用1H-NMR、FT-IR和XRD對(duì)該材料進(jìn)行了譜學(xué)表征，用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)和伊紅-蘇木精染色實(shí)驗(yàn)對(duì)其細(xì)胞毒性和體外抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)估，并用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)、粒徑和表面電勢(shì)的測(cè)定及攜帶siRNA的細(xì)胞熒光染色實(shí)驗(yàn)，初步研究了聚合物的siRNA壓縮能力與攜帶能力。結(jié)果：合成了雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精聚陽(yáng)離子復(fù)合物，且雷公藤內(nèi)酯的接入率為10%(w/w)。聚合物在N/P為5時(shí)具有較好的siRNA壓縮能力，形成粒徑約為(300±15)nm和表面電荷為(8±2.5)mV的微粒，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及HE染色實(shí)驗(yàn)表明雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精聚合物毒性降低，具有較好的抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，能有效攜帶siRNA并進(jìn)入細(xì)胞中。結(jié)論：雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精可在體外抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，并可攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，有望用于腫瘤的基因/藥物協(xié)同治療。

環(huán)糊精類/化學(xué);聚乙烯亞胺/化學(xué);雷公藤內(nèi)酯/治療應(yīng)用;抗腫瘤藥/藥理學(xué);納米復(fù)合物;聚乙烯亞胺;環(huán)糊精;雷公藤內(nèi)酯醇;抗腫瘤活性

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):610-619.］

雷公藤內(nèi)酯醇是傳統(tǒng)中藥雷公藤的有效成分，對(duì)腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病具有獨(dú)特的治療效果［1-2］。研究和臨床用藥顯示雷公藤內(nèi)酯醇毒性較大，治療窗口較窄［3］，因此，對(duì)其進(jìn)行藥物劑型的修飾，在保證其療效的同時(shí)，降低其毒副作用，是一項(xiàng)有意義的研究。

將藥物連接在高分子載體材料上制成緩釋制劑，可以防止藥物“暴釋”產(chǎn)生的急性毒性。緩釋和靶向藥物在血管內(nèi)有透過(guò)性增強(qiáng)及滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)，可以被動(dòng)靶向到炎癥或腫瘤組織，減少全身毒性［4］。

本研究以聚乙烯亞胺-環(huán)糊精為載體材料，將雷公藤內(nèi)酯醇經(jīng)活化后偶合于載體材料上，制成雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精復(fù)合物，對(duì)所合成的復(fù)合物藥物進(jìn)行了表征，考察其體外細(xì)胞毒性和抗癌活性。聚乙烯亞胺-環(huán)糊精是一種陽(yáng)離子載體，可以攜帶DNA或siRNA，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在其偶合雷公藤內(nèi)酯后可攜帶siRNA，具有實(shí)現(xiàn)藥物-基因協(xié)同釋放的可能，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)藥物-基因協(xié)同釋放打下了一定的研究基礎(chǔ)［5］。

1 材料與方法

1.1 材料 聚乙烯亞胺(PEI 600 Da)，環(huán)糊精(CyD)，甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，N，N'-羰基二咪唑(N，N'-carbonyldiimidazole，CDI)購(gòu)自 Aldrich-Sigma 公司。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)購(gòu)自成都普瑞法生物科技公司。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的 siRNA購(gòu)自Qiagen公司。人胚胎腎上皮細(xì)胞系HEK-293、人肝癌細(xì)胞系 BEL-7402、SMC-7721購(gòu)自南京凱基生物科技公司，由實(shí)驗(yàn)室保種。其它實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的合成聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的合成方法參照文獻(xiàn)［6-7］。將聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(56.1 mg)溶于25 ml DMSO中備用;稱取雷公藤內(nèi)酯醇9.8 mg(0.027 mmol)，溶于5 ml DMSO 中;CDI 9.9 mg(0.061 mmol)，溶于 5 ml DMSO 中;將雷公藤內(nèi)酯醇溶液與CDI溶液一起加入50 ml圓底燒瓶中，避光、充氮?dú)獗Ｗo(hù)，再加入100μl三乙胺為催化劑，反應(yīng)1.5 h。將已配好的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精溶液慢慢滴入上述反應(yīng)體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)避光條件下反應(yīng)過(guò)夜。將反應(yīng)液取出，用MW 8 000～14 000透析膜在流動(dòng)純水中透析48 h。冷凍干燥3 d，得到產(chǎn)物。

1.3 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的表征核磁共振表征 分別取聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精3～5 mg，用1 000μl D2O溶解。室溫下用 Brunker Avance 400 DMX核磁共振光譜儀進(jìn)行分析。紅外光譜分析:分別取聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精1～2 mg制成KBr鹽片，室溫下用 Thermo Nicolet AVATER 330傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析。粉末X射線衍射分析:將聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇單體在D/Max-2550Pc上進(jìn)行粉末X-衍射譜分析。

1.4 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的細(xì)胞毒性與抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng) 將HEK-293細(xì)胞置于含10% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將BEL-7402、SMC-7721細(xì)胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性:將 HEK-293、BEL-7402、SMMC-7721細(xì)胞接種到96孔板上，細(xì)胞數(shù)為 1.0 × 104細(xì)胞/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精用無(wú)血清的培養(yǎng)液DMEM或1640配制成濃度梯度(0.1、0.2、0.5、1、2 μg/ml)的溶液，由核磁氫譜分析提示雷公藤內(nèi)酯醇接入率約為10%，作為對(duì)比，雷公藤內(nèi)酯醇單體用無(wú)血清的培養(yǎng)液DMEM或 1640配制成濃度梯度(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg/ml)的溶液。吸去每孔中培養(yǎng)液，加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每孔0.2 ml，3 復(fù)孔，共溫育 4 h 后，吸去培養(yǎng)液，加入含有10%MTT(0.5 mg/ml)的有血清培養(yǎng)液100μl，培養(yǎng)3 h后翻板棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO檢測(cè)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。細(xì)胞活性=樣本OD/空白對(duì)照組OD×100%。

腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響:將BEL-7402細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成濃度為1.5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以1 ml/孔接種于24孔板中，于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～24 h，使之形成單層細(xì)胞。用10μl移液槍在單層細(xì)胞上劃“一”字劃痕，用PBS清洗三次，在倒置相差顯微鏡下拍照。用無(wú)血清培養(yǎng)液，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精溶液，和濃度為 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇單體溶液，另配制 0.1、0.2、0.5、1、2 μg/ml的未接入雷公藤內(nèi)酯醇的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精溶液作為陰性對(duì)照。將以上溶液分別加入劃過(guò)的24孔板中，每孔1 ml，于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24 h后換成含10%小牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h。在倒置相差顯微鏡下拍照，并將照片與加藥前的劃痕照片對(duì)比。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn):分別將 HEK-293、BEL-7402、SMMC-7721三種細(xì)胞配成濃度為2.5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于24孔板中。用無(wú)血清培養(yǎng)液配制濃度為 0.1、0.5、2 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精溶液和濃度為 0.01、0.05、0.2 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇單體溶液，另配制 0.1、0.5、2 μg/ml的未接入雷公藤內(nèi)酯醇的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精溶液作為陰性對(duì)照，分別加入接種有三種細(xì)胞的24孔板中，每孔1 ml，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，吸出孔中液體，用PBS清洗后甲醛固定10 min，按順序加入蘇木精和伊紅染色，清洗后加入少量PBS在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的siRNA壓縮能力與攜帶能力凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)將聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精與siRNA(濃度為1μg/μl)按一定的N/P(PEI的氮元素摩爾數(shù):siRNA中磷元素摩爾數(shù))混合，加入1%瓊脂糖(含有0.5μg/μl溴化乙啶)制備的凝膠孔中，在1×TAE緩沖液中80 V電泳45 min。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察載體材料阻滯siRNA的合適N/P比。

粒徑和表面電勢(shì)的測(cè)定:將聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精與質(zhì)粒混合，制備不同N/P的復(fù)合物(含siRNA 1 μg)，用水稀釋至 1 ml，在 Malvern Zetasizer粒徑檢測(cè)儀上測(cè)試粒徑與表面電勢(shì)。

攜帶siRNA的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn):將聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精與FITC標(biāo)記的siRNA混合，制備N/P為30/1的復(fù)合物(含siRNA 1μg)，用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至1 ml，加入孔中，于 37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中孵育。4 h后，吸去24孔板中液體，加入甲醛固定10 min，并用Hoechest染料染色后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的合成結(jié)果 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的合成路線如圖1所示。整個(gè)反應(yīng)體系為非水體系，實(shí)驗(yàn)選用DMSO作為溶劑，三乙胺為催化劑。在反應(yīng)體系中活化劑N，N-羰基咪唑與雷公藤內(nèi)酯醇的摩爾比為2.25∶1，反應(yīng)表明本實(shí)驗(yàn)條件可以確保雷公藤內(nèi)酯醇完全活化?；罨蟮睦坠賰?nèi)酯醇與聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的摩爾比為1∶1.15，為使反應(yīng)完全，雷公藤內(nèi)酯活化物滴加入聚乙烯亞胺-環(huán)糊精體系的速度需控制，以防止局部過(guò)濃現(xiàn)象。反應(yīng)物經(jīng)過(guò)透析和冰凍干燥后得白色的絮狀物。

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)表征結(jié)果 氫核磁共振表征結(jié)果:圖2A是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的圖譜，在化學(xué)位移2.5～2.8和4.8范圍內(nèi)有環(huán)糊精上亞甲基和次甲基(-CH2、-CH-)的吸收峰;圖2B是雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的圖譜，從圖上可以看出，除了仍保留聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的特征吸收峰外，在化學(xué)位移0.72(二重峰)、0.85(二重峰)、0.94(單峰)處有吸收信號(hào)，分別對(duì)應(yīng)于雷公藤內(nèi)酯醇的16、17和20位碳上的甲基，根據(jù)雷公藤內(nèi)酯醇上的甲基H與環(huán)糊精1位碳H的計(jì)算，雷公藤內(nèi)酯的接入率為10%。

傅里葉紅外光譜表征結(jié)果:圖3A是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇單體的紅外光譜圖。從圖中可以看出，與未接入雷公藤內(nèi)酯醇的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精相比，雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在1752 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)羰基峰，其為雷公藤內(nèi)酯醇內(nèi)酯環(huán)上的羰基產(chǎn)生的吸收。從紅外圖譜吸收峰可以說(shuō)明雷公藤內(nèi)酯醇已偶合于載體材料。

圖2 聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(A)和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(B)的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of PEI-CyD(A)and TPL-PEI-CyD(B)

X射線衍射分析結(jié)果:圖3B為聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇單體的粉末XRD圖譜，由圖可知聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(a)為無(wú)定形化合物，雷公藤內(nèi)酯醇(b)為結(jié)晶型化合物，雷公藤內(nèi)酯醇偶合于聚乙烯亞胺-環(huán)糊精后，其結(jié)構(gòu)也為無(wú)定形，但是衍射峰的峰位發(fā)生了位移，表明雷公藤內(nèi)酯醇已經(jīng)偶合于載體材料上。

圖3 聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇單體的紅外圖譜(A)和粉末XRD圖譜(B)Fig.3 FT-IR spectra of TPL，TPL-PEI-CyD，PEI-CyD(A);XRD image of TPL，TPL-PEI-CyD，PEI-CyD(B)

2.3 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的細(xì)胞毒性與抗腫瘤活性 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)材料對(duì)正常細(xì)胞毒性和對(duì)腫瘤細(xì)胞抗癌活性的重要手段。實(shí)驗(yàn)選取HEK-293細(xì)胞、BEL-7402和SMMC-7721肝腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)試了雷公藤內(nèi)酯和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精對(duì)細(xì)胞的毒性。圖4是MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖上可以看出，雷公藤內(nèi)酯醇在接入聚乙烯亞胺-環(huán)糊精后，對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯降低，對(duì)癌細(xì)胞的抑制率則無(wú)顯著變化，表明雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在一定程度上降低雷公藤內(nèi)酯醇毒性的同時(shí)保留其抗癌活性。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)選取人肝癌細(xì)胞BEL-7402細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別測(cè)試了不同濃度的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。如圖5A和5B所示，聚乙烯亞胺-環(huán)糊精本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移沒有顯著影響，雷公藤內(nèi)酯醇則可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力比雷公藤內(nèi)酯醇更強(qiáng)，抑制腫瘤遷移的作用就越明顯，這可能與雷公藤內(nèi)酯醇與載體材料連接后更易被細(xì)胞內(nèi)化有關(guān)。

圖4 雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在HEK-293、BEL-7402和SMMC-7721肝腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Cytotoxicity of TPL and TPL-PEI-CyD by MTT assay in HEK-293，BEL-7402 and SMMC-7721 cell lines

細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:圖6是不同濃度的聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在SMMC-7721細(xì)胞上的HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖6中與可以看出，聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度下對(duì)細(xì)胞均無(wú)明顯影響，但雷公藤內(nèi)酯醇在濃度較低時(shí)就呈現(xiàn)出很明顯的細(xì)胞毒性。與單體相比，雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的毒性要小一些，在低濃度時(shí)幾乎與聚乙烯亞胺-環(huán)糊精相同，只有在高濃度時(shí)才呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

2.4 雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的siRNA壓縮能力與攜帶能力凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖7A是聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的瓊脂糖凝膠電泳滯緩實(shí)驗(yàn)照片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在N/P為3∶1時(shí)能壓縮siRNA，而雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精則在N/P為5∶1時(shí)可以縮合siRNA。可以推測(cè)，當(dāng)雷公藤內(nèi)酯醇偶合于聚乙烯亞胺-環(huán)糊精載體材料上后，載體材料表面的氨基數(shù)減少，同時(shí)，由于雷公藤內(nèi)酯醇的接入使雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精/siRNA微粒的致密程度有所降低，使雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精結(jié)合siRNA的能力略有減弱。但總的來(lái)說(shuō)，雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精保留了較好的基因壓縮能力，有利于攜帶核酸進(jìn)入細(xì)胞。

圖5 聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精在人肝癌細(xì)胞BEL-7402細(xì)胞上抑制細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A)，細(xì)胞遷移率(B)Fig.5 Results of cell wound healing assay in BEL-7402 cell line using PEI-CyD，TPL and TPL-PEI-CyD(A);The rate of cell migration(B)

粒徑與表面電勢(shì)的測(cè)定結(jié)果:在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中，載體材料與siRNA復(fù)合物所形成微粒的大小和表面電勢(shì)與基因轉(zhuǎn)染效率有很大關(guān)系。圖7B是雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精攜帶siRNA后的粒徑大小和表面電荷的結(jié)果，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知其粒徑隨N/P的增加而降低，當(dāng)N/P=30時(shí)，復(fù)合物的粒徑約在300±15nm左右，復(fù)合物的表面電勢(shì)則穩(wěn)定在(8±2.5)mV左右，可以滿足非病毒基因載體高效轉(zhuǎn)染的需要。

攜帶siRNA的細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果:為考察雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的siRNA攜帶能力，我們用聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精材料攜帶了標(biāo)記FITC的siRNA進(jìn)行細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，以HEK-293細(xì)胞為研究對(duì)象。經(jīng)過(guò)4h吞噬后用Hoechest染料對(duì)細(xì)胞核染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種聚合物對(duì)siRNA的吞噬情況。結(jié)果如圖8所示，上圖為PEI-CyD材料，下圖為偶合雷公藤內(nèi)酯醇的PEI-CyD聚合物，由圖可知兩者都均可以攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞中，并分布于細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論

近年來(lái)，具有抗腫瘤活性的天然藥物引起了研究者的極大興趣，如紫杉醇［6］，已被商品化并被廣泛用于臨床腫瘤化療中。然而，許多天然產(chǎn)物在具有很高抗腫瘤活性的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生一定的細(xì)胞組織毒性，在一定程度上妨礙了這些藥物的臨床應(yīng)用。

從雷公藤中分離出的有效成分雷公藤內(nèi)酯醇是一種天然藥物，其抗腫瘤活性、免疫抑制功能和毒性引起了研究者的廣泛關(guān)注。雷公藤內(nèi)酯醇已被證明對(duì)不同種類的癌細(xì)胞有較好的抗腫瘤活性［1，7-9］，對(duì)一些多藥耐藥的癌細(xì)胞也有療效［1，10］，其還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)其他化療藥物的敏感性［11-15］。此外，雷公藤內(nèi)酯醇還具有較強(qiáng)的免疫活性，在多種自身免疫病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的動(dòng)物模型中有較好療效［16］。但雷公藤內(nèi)酯醇毒性較大，毒性呈劑量依賴性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高于治療劑量2到4倍的用量即可致死［17］，顯示其治療窗口較窄。鑒于其在腫瘤(尤其是白血病)和自身免疫病動(dòng)物模型中的良好療效，從上世紀(jì)60年代起，中國(guó)和美國(guó)的研究人員就嘗試將雷公藤內(nèi)酯醇商品化［18］，但終因治療窗口太窄未能成功。針對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇活性高、毒性大的特點(diǎn)，很多研究者試圖通過(guò)改造雷公藤內(nèi)酯醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)，篩選活性相對(duì)較高且毒性較低的衍生物。雷公藤內(nèi)酯醇分子中14位羥基是最容易修飾的基團(tuán)之一，通過(guò)它可以引入多種基團(tuán)。已有的研究表明，通過(guò)對(duì)14位羥基進(jìn)行取代反應(yīng)引入親水基團(tuán)不僅可以解決雷公藤內(nèi)酯醇水溶性差的問(wèn)題，還可以大大降低雷公藤內(nèi)酯醇的毒性［17］。Zhang等在研究中將雷公藤內(nèi)酯醇的14位羥基活化后，通過(guò)丁二酸酐與溶菌酶鍵合，制得了雷公藤內(nèi)酯醇-溶菌酶復(fù)合物，該復(fù)合物降低了雷公藤內(nèi)酯醇的全身毒性，并可以利用腎臟截留大分子的能力，使雷公藤內(nèi)酯醇被動(dòng)靶向到腎臟，提高了其藥效，是很有應(yīng)用前景的一次嘗試［19］。

圖6 聚乙烯亞胺-環(huán)糊精、雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精和雷公藤內(nèi)酯醇單體在 SMMC-7721細(xì)胞株的伊紅-蘇木精染色實(shí)驗(yàn)Fig.6 HE staining images of PEI-CyD，TPL-PEI-CyDand TPL in SMMC-7721 cell line

在本研究中，我們嘗試將雷公藤內(nèi)酯醇的14位羥基活化后，與聚乙烯亞胺-環(huán)糊精偶合，制備了雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精復(fù)合物。紅外光譜、核磁共振氫譜與X射線衍射結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯醇用N，N-羰基二咪唑(CDI)活化后，可以偶合于聚乙烯亞胺側(cè)鏈上的氨基，且雷公藤內(nèi)酯的藥物結(jié)合率達(dá)10%(w/w)左右。研究以人胚胎腎上皮細(xì)胞系 HEK-293、人肝癌細(xì)胞系 BEL-7402、SMC-7721為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和HE染色實(shí)驗(yàn)分別從細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移和細(xì)胞形態(tài)學(xué)等方面證明，與雷公藤內(nèi)酯醇單體相比，雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精復(fù)合物毒性降低，但仍保留了較好的抗腫瘤活性。

圖9 激光共聚焦顯微鏡觀察聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(上)和雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(下)被HEK-293細(xì)胞株攝取圖像Fig.9 CLSM images of the cellular uptake of PEI-CyD(Up)and TPL-PEI-CyD(Down)in HEK-293 cell lines

在本研究中，我們還研究了雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精攜帶siRNA的能力。近年來(lái)，針對(duì)腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，很多研究者嘗試運(yùn)用基因-藥物協(xié)同療法，即將基因和藥物同時(shí)運(yùn)送至癌細(xì)胞內(nèi)部的方法，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用量［20-23］。實(shí)驗(yàn)用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)評(píng)估了雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精壓縮siRNA的能力，表明雷公藤內(nèi)酯醇的接入對(duì)聚乙烯亞胺-環(huán)糊精的基因壓縮能力有一定影響，但在N/P約為5時(shí)仍可有效壓縮siRNA。雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精與siRNA形成的復(fù)合物粒徑隨N/P增加而減小，在N/P大于30時(shí)，復(fù)合物的粒徑在300 nm，表面電荷在8 mV左右，有利于復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞的吞噬［4］。我們還使用攜帶熒光標(biāo)記的siRNA，通過(guò)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，證明了雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精可以有效攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。為進(jìn)一步攜帶具有治療作用的基因和siRNA的研究工作打下了一定的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功合成并表征了一種雷公藤內(nèi)酯醇-聚陽(yáng)離子高分子復(fù)合物。在下一步實(shí)驗(yàn)中，我們將用雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精攜帶不同種類的治療性siRNA，通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考察雷公藤內(nèi)酯醇-聚乙烯亞胺-環(huán)糊精介導(dǎo)的基因-藥物協(xié)同治療腫瘤、紅斑狼瘡等疾病的療效。

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Anticancer effect of triptolide-polyethylenimine-cyclodextrin in vitro

HU Tian-nan，WANG Qi-wen，JIN Xue，HU Qi-da，WANG Xun-shi，XU Sang，ZHOU Jun，TANG Gu-ping
(Institute of Chemical Biology and Pharmaceutical Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310028，China)

Objective:To develop a drug delivery system triptolide-polyethylenimine-cyclodextrin and to evaluate its anticancer activity in vitro.Methods:Triptolide was conjugated to polyethylenimine-cyclodextrin by N，N'-carbonyldiimidazole to form triptolide-polyethylenimine-cyclodextrin.1H-NMR，F(xiàn)T-IR and XRD were used to confirm its structure.The anticancer effect of the polymer was assessed by MTTassay，erasion trace test and hematoxylin-eosin staining.The potential to condense siRNA and to delivery siRNA into cytoplasm was demonstrated by gel retardation assay，zeta-potential determination and fluorescence staining.Results:Triptolide was successfully conjugated to polyethylenimine-cyclodextrin and the conjugation rate of triptolide was 10%(w/w).siRNA was effectively condensed by the polymer at the N/Pratio of 5，and its particle size was 300±15 nm and zeta potential was 8 ±2.5 mV.MTT assay，erasion trace test and hematoxylin-eosin staining revealed that triptolide-polyethylenimine-cyclodextrin had anticancer effect and low cytotoxicity to normal cells.The polymer was able to deliver siRNA to the cytoplasm effectively as demonstrated by fluorescence staining.Conclusions:Triptolide-polyethylenimine-cyclodextrin is able to inhibit the growth and migration of cancer cells in vitro and to carry siRNA into cells effectively.It is potential to be used as a novel prodrug for co-delivery of gene and drug in cancer treatment.

Cyclodextrin/chemistry;Polyethyleneimine/chemistry;Triptolide/therapeutic use;Antineoplastic drugs/pharmacology;Nanocomposites;Polyethylenimine;Cyclodextrin;Triptolide;Anticancer ability

R 730.54

A

1008-9292(2012)06-0610-10

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.003

2012-09-07

2012-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助項(xiàng)目(30970711，21074111).

胡天楠(1993-)，男，本科生，化學(xué)專業(yè).

湯谷平(1961-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物材料、藥物的控制釋放和基因治療等;E-mail:tangguping@zju.edu.cn

［責(zé)任編輯 張榮連］