李永斌，王 凱，胡天楠，王啟聞，胡奇達，周 峻，胡秀榮，湯谷平

主客體組裝的金剛烷甲酸-阿霉素/聚陽離子材料及體外抗腫瘤活性的研究

李永斌1，王 凱1，胡天楠1，王啟聞1，胡奇達1，周 峻1，胡秀榮2，湯谷平1

(1.浙江大學(xué)化學(xué)生物和藥物研究所，浙江杭州310028;2.浙江大學(xué)化學(xué)系分析測試中心，浙江杭州310028)

目的：合成以金剛烷甲酸阿霉素(Ada-Dox)為客體，聚乙烯亞胺PEI600-γ-羥丙基環(huán)糊精(γ-hy-PC)為主體的超分子納米材料，觀察其理化特性和轉(zhuǎn)基因功能。方法：通過主客體相互作用將Ada-Dox組裝到 γ-hy-PC材料上，制成 γ-hy-PC/Ada-Dox的載藥納米粒子。用1H-NMR、NOESY、UV-Vis、XRD、TGA對其結(jié)構(gòu)進行表征，粒徑和電勢的測定和凝膠電泳阻滯實驗觀察其濃縮質(zhì)粒DNA的能力，在人肝癌細胞BEL-7402和SMMC-7721細胞上對載體材料的細胞毒性進行評價，并進行細胞遷移和細胞形態(tài)學(xué)鑒定實驗，在HEK293細胞上進行體外轉(zhuǎn)染實驗以及在BEL-7402細胞上進行細胞吞噬實驗。結(jié)果：1H-NMR、NOESY、UV-Vis、XRD、TGA證實成功地合成了γ-hy-PC/Ada-Dox復(fù)合物;UV-Vis測得其載藥量分別是0.5%和5.5%;載藥量0.5%和5.5%的γ-hy-PC/Ada-Dox分別在N/P為3和4時可以濃縮質(zhì)粒DNA;MTT實驗結(jié)果顯示材料的毒性均低于PEI 25 kDa;細胞遷移與H/E染色實驗表明合成的材料都有一定的抗腫瘤活性;體外轉(zhuǎn)染實驗顯示，γ-hy-PC具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且隨著載藥量的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低;細胞吞噬實驗結(jié)果表明γ-hy-PC/Ada-Dox可同時攜帶藥物和FAM-siRNA進入細胞。結(jié)論：成功地合成了γ-hy-PC/Ada-Dox復(fù)合物，并表現(xiàn)出一定基因轉(zhuǎn)染效率和抗腫瘤活性。

多柔比星/類似物和衍生物;多柔比星/藥理學(xué);抗腫瘤藥/藥理學(xué);γ-羥丙基環(huán)糊精;聚乙烯亞胺;阿霉素;納米粒載體

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):599-609.］

非病毒性基因藥物載體的研究是目前藥物載體領(lǐng)域的一個重要方向，研制安全有效的藥物、基因輸送體系將有效地提高藥物的輸送效率，達到治愈疾病的目的［1-4］。主客體組裝的藥物輸送體系是一種新穎的給藥系統(tǒng)，它具有提高藥物的載藥量，并依據(jù)藥物的親疏水性質(zhì)及有效血藥濃度，調(diào)控藥物載量等特點［5-6］。何斌等將α-環(huán)糊精(α-CD)穿入肉桂酸改性的PEG分子鏈形成包含復(fù)合物，通過超分子自組裝成為納米粒子，將抗腫瘤藥物阿霉素負載到納米粒子中，研究藥物釋放行為及其對腫瘤細胞的抑制效果［7］。李姝靜等合成了環(huán)糊精二聚體(trans-Azoβ-CD Dimer)及側(cè)鏈含金剛烷(Ad)的聚丙烯酰胺(PAM-Ad)，利用trans-Azoβ-CD Dimer與PAM-Ad側(cè)鏈的Ad基團的主客體識別作用構(gòu)筑了一類超分子體系［8］。胡奇達等以小分子的聚乙烯亞胺作為橋聯(lián)偶合β-環(huán)糊精制成主體材料，金剛烷連接阿霉素為客體材料，制備了主客體組裝的載藥體系［9］。我們研究發(fā)現(xiàn)，主客體組裝的藥物基因輸送體系，以弱的分子間作用力聯(lián)接主客體材料，并可以荷載小分子藥物和基因藥物，依據(jù)所需的有效治療濃度，控制藥物的載藥量，調(diào)控藥物和基因的釋放順序。在本研究中，以分子量為600 Da的聚乙烯亞胺為橋聯(lián)偶合 γ-羥丙基-環(huán)糊精(γ-hy-cyclodentrin)制成具有規(guī)整、交替結(jié)構(gòu)的聚合物主體材料，用金剛烷甲酸修飾抗腫瘤藥物制成客體材料，經(jīng)分子間的相互作用組裝成具有主客體結(jié)構(gòu)的超分子藥物輸送體系。對主客體藥物輸送體系進行了化學(xué)、生物物理學(xué)、細胞學(xué)等性質(zhì)的表征，結(jié)果表明該藥物-基因輸送系統(tǒng)具有良好的載藥性能，為進一步深入研究提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料 γ-羥丙基-環(huán)糊精(2-(Hydroxypropyl)-γ-Cyclodextrin)，購自阿拉丁;1-金剛烷甲酸(1-Adamantanecarboxylic acid)，聚乙烯亞胺(polythylenimine，PEI，分子量分別為 25kDa與 600Da)，N，N'-羰 基 二 咪 唑 (N，N'

-carbonyldiimidazole，CDI，分子量:162.15)，甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl-tetrazolium，MTT)均購自 Sigma-Aldrich公司;蘇木精(Hematoxylin)購自南京建成生物工程研究所;伊紅(Eosin)購自上海三愛思試劑有限公司;編碼螢火蟲熒光素酶(PGL-4)報告基因，熒光素酶檢測試劑盒購于 Promega公司。HEK293、BEL-7402、BEL-7404和 SMMC-7721細胞系由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所提供。其它試劑均為分析純。

1.2 材料的合成

1.2.1 Ada-Dox的合成 取金剛烷甲酸0.0393 g(0.2183 mmol) 溶于 1 ml DMSO 中，加到 25 ml圓底燒瓶中，取 N，N-羰基咪唑(CDI)0.0477g(0.2942 mmol) 溶 于 1 ml DMSO加到上述溶液中，滴加時間5 min以上，加0.2 ml三乙胺(Et3N)作催化劑，室溫、避光、氮氣保護下攪拌 2.5 h。取 0.111 g阿霉素(0.2044 mmol)于2 ml DMSO中，逐滴加入到上述反應(yīng)液中，滴加時間20 min以上，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液用干燥活化的硅膠板展開分離，展開劑為異丙醇∶氯仿=1∶1，經(jīng)提純后制得產(chǎn)物。

1.2.2 γ-hy-PC 的合成 取 1.622 g(1.027 mmol)2-羥丙基-γ-環(huán)糊精(γ-hy-CyD) 于10 ml DMSO中，加到100 ml圓底燒瓶中，取1.70 g(10.50 mmol)CDI溶于10 ml DMSO加到上述溶液中，加0.2 ml三乙胺(Et3N)作催化劑，室溫、避光、氮氣保護下攪拌 5 h。取 5.56 g(9.269 mmol)PEI 600 Da 于10 ml DMSO 中，逐滴加入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)12 h。將反應(yīng)產(chǎn)物置于分子量為8 000～14 000的透析袋中，流水透析48 h，冰凍干燥，得到白色絮狀固體產(chǎn)物。

1.2.3 γ-hy-PC/Ada-Dox的合成 將上述反應(yīng)的Ada-Dox 1.5 ml加入到15 ml PBS緩沖溶液中，攪拌30 min以除去過量的 CDI。稱取0.3393 g(0.2150 mmol) γ-hy-PC 于 8 ml PBS緩沖溶液中，將該溶液加入到上述溶液中，攪拌過夜。然后將反應(yīng)產(chǎn)物置于分子量為8 000～14 000的透析袋中，流水透析48 h，冰凍干燥，得到紫紅色絮狀固體產(chǎn)物。

1.3 材料的理化表征

1.3.1 核磁共振氫譜(1H-NMR)分析 將5 mg樣品溶于0.5 ml D2O或DMSO-d6中。室溫下用Bruker Avance400DMX核磁共振光譜儀(Bruker公司，德國)測定。

1.3.2 核歐佛豪瑟效應(yīng)頻譜(NOESY spectrum) 取20 mgγ-hy-PC/Ada-Dox超分子聚合物，溶于1 ml D2O中，室溫下用 Bruker Avance 400DMX核磁共振光譜儀(Bruker公司，德國)測定。

1.3.3 紫外-可見光譜(UV-Vis) 將Dox和γ-hy-PC/Ada-Dox配成一定的濃度，以紫外分光光度儀在250～700 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，觀察紫外吸收光譜變化并確定最大吸收波長。將Dox配成一系列不同濃度的溶液，在最大吸收波長出測定吸光度，制得標準曲線。將γ-hy-PC/Ada-Dox配成一定濃度的溶液，測定其吸光度，根據(jù)標準曲線，計算Dox的載藥量。

（2）轉(zhuǎn)換層設(shè)計斜柱，安裝質(zhì)量控制要求高：由于建筑布置要求，周邊型鋼混凝土柱 2 F 樓面標高開始逐層向外傾斜，到 4 F 樓面標高恢復(fù)直立狀態(tài)，外圍型鋼柱呈向內(nèi)折線形，吊運安裝質(zhì)量控制要求高。

1.3.4 X-射線粉末衍射(XRD) 樣品(100 mg左右)研磨成粉狀，多晶衍射儀 D/Max22550Pc(日本理學(xué))測定。

1.3.5 熱重分析(TGA) 稱取3～4 mg干燥的樣品，用SDTQ600綜合熱分析儀(美國TA公司)對樣品進行熱失重分析。溫度從30℃升至700℃，升溫速率為10℃/min，N2保護，流速120 ml/min。

1.3.6 粒徑與zeta電位測定(Particle size and Zeta potential) 將材料與pDNA按照適宜的N/P 比值(N/P=10、20、30、40) 配制溶液，其中DNA取1μg，最后稀釋至1 ml水溶液，在Mastersizer-2000型激光衍射粒度分析儀上測定粒徑。

1.4 凝膠電泳阻滯實驗 將材料與pDNA按照適宜的 N/P 比值(N/P=0、1、2、3、4、5) 配制溶液，其中DNA取1μg，加入到1%瓊脂糖凝膠孔中，在1×TAE緩沖液中80V、電泳 45 min。電泳結(jié)束后，在JS-380A自動凝膠圖像分析儀上測定載體材料阻滯DNA的位置。

1.5 細胞毒性實驗 將人肝癌細胞BEL-7402和SMMC-7721細胞分別接種于96孔板上，10 000細胞/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 16 h。吸去培養(yǎng)液，加入 N/P分別為 10、20、30、40、50、60 的材料溶液200 μl，3 復(fù)孔，孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，加入含有10μl MTT(5 mg/ml)的無血清培養(yǎng)液100μl，孵育4 h后翻板棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO，在570 nm波長下測定OD值，計算細胞活力。

1.6 細胞遷移實驗(細胞劃痕法) 將HEK293和 BEL-7404細胞(3×105個/孔，500 μl/孔)接種于6孔板上，37℃孵育16 h。移去培養(yǎng)液，用10μl的移液器槍頭呈“一”劃痕，然后用PBS洗2遍，加入N/P為30的材料和DNA的混合溶液500μl，其中DNA取1μg，于37℃孵育4 h，移去藥液，用PBS清洗，再分別加入含10%小牛血清的DMEM和RPMI1640培養(yǎng)液，分別于0 h、24 h、48 h 觀察。

1.7 H/E染色 將BEL-7402細胞(1×105個/孔，1 ml/孔)接種于12孔板上，37℃孵育16 h。移去培養(yǎng)液，然后用PBS洗2遍，加入N/P為30的材料和DNA的混合溶液1 ml，其中DNA取1μg，于37℃孵育12 h。移去藥液，用PBS清洗，加入500μl 5%甲醛溶液固定10 min，吸出并用PBS清洗。每孔加入500μl蘇木精染料，振蕩40～60 min，吸出蘇木精染料并用PBS清洗直到PBS中無藍色為止，然后每孔加入300μl伊紅染料，約30 s后吸出并用PBS清洗直到PBS中無橘黃色為止，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 體外細胞轉(zhuǎn)染 將HEK293細胞按2×104個/孔鋪于48孔板上，37℃孵育16 h。將載體 材 料 PEI600、γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)、γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)與PGL-4(1 μg)按照 N/P=15、20、25、30、35，PEI 25 kD 與PGL-4質(zhì)粒(1μg)按照N/P=10比值混合，靜置30 min后加入各孔，每種N/P三復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4 h，去掉培養(yǎng)液，加入含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，PBS洗滌細胞一次，采用反復(fù)凍融法使細胞破裂。采用Promega公司的熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性，采用BCA試劑盒檢測總蛋白量。最后用“相對熒光單位/mg蛋白”(RLU/mg protein)表示轉(zhuǎn)染效率。將HEK293細胞按5×104個/孔鋪于24孔板上，37℃孵育16 h。將載體材料 γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)與 pEGFP質(zhì)粒(1μg)按照 N/P=30混合，靜置30 min后加入各孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4 h，去掉培養(yǎng)液，加入含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)36～48 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 材料的合成結(jié)果 圖1a為聚合物γ-hy-PC的合成路線圖，γ-hy-CyD中8位上的羥基，因為空間位阻較小，易于被活化，實驗選用N，N-羥基二咪唑(CDI)為活化劑，將其活化后與分子量為600的聚乙烯亞胺反應(yīng)，制得聚乙烯亞胺-γ-羥丙基-環(huán)糊精(PEI600-γ-hy-CyD)。應(yīng)注意的是，在反應(yīng)過程中應(yīng)控制聚乙烯亞胺的滴加速度，以防止溶液的局部過濃導(dǎo)致交聯(lián)沉淀。圖1b為金剛烷-阿霉素的合成路線，金剛烷甲酸中的羧羥基易于活化劑CDI作用，可與阿霉素六元雜環(huán)上的氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。圖1c為γ-hy-PC/Ada-Dox超分子聚合物的合成示意圖，Ada-Dox通過弱的分子間作用力，以主客體形式嵌入γ-hy-PC的疏水性空腔內(nèi)，形成超分子聚合物 γ-hy-PC/Ada-Dox。本實驗中Ada-Dox與γ-hy-PC的比例是按照理論重量比1%和8%進行投料的。

2.2 材料的表征結(jié)果 圖2是以DMSO-d6為溶劑的阿霉素(Dox)(a)、1-金剛烷甲酸(Ada-COOH)(b)、Ada-Dox化合物(c)以及以D2O為溶劑的 γ-hy-PC(d)、γ-hy-PC/Ada-Dox(e)的核磁共振氫譜。圖2a中δ=4.87ppm處為Dox的特征質(zhì)子吸收峰。圖2b中 δ=1.5～2.0 ppm間三個吸收峰為Ada-COOH烷基的特征質(zhì)子吸收峰。圖2c中 δ=1.5～2.0 ppm間和 δ=4.85 ppm等位移處同時具備了Ada-COOH烷基和Dox的特征質(zhì)子吸收峰，說明形成了新的化合物，即Ada-Dox。此樣品通過薄層層析分離得到，說明是單一的物質(zhì)。圖2e中δ=1.6，1.9 ppm 處可見 Ada-COOH 中烷基的特征吸收峰，在δ=1.0 ppm可見γ-hy-PC中未改變的甲基的特征吸收峰，說明客體Ada-Dox已成功通過主客體相互關(guān)系與主體γ-hy-PC組裝起來，并形成超分子聚合物γ-hy-PC/Ada-Dox。

圖1 γ-hy-PC/Ada-Dox超分子載體材料的合成路線Fig.1 Synthesis route ofγ-hy-PC/Ada-Dox

圖3 a為γ-hy-PC/Ada-Dox的核歐佛豪瑟效應(yīng)頻譜。NOESY的交叉峰表明二個質(zhì)子之間有足夠強的NOE效應(yīng)，通常二個質(zhì)子之間的距離不大于5?時才可能觀測到NOE效應(yīng)。γ-hy-PC/Ada-Dox的核歐佛豪瑟效應(yīng)頻譜中，客體金剛烷甲酸中亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號與主體γ-hy-CyD中的質(zhì)子信號有很好的關(guān)聯(lián)，說明γ-hy-CyD與Ada-Dox之間存在疏水鍵結(jié)合的主客體相互關(guān)系，并已形成超分子化合物。

圖3b 為 Dox、γ-hy-CyD、γ-hy-PC 和 γ-hy-PC/Ada-Dox的粉末衍射圖譜。從圖中可以看出 Dox 為結(jié)晶性化合物，在 25.0(°)、17.2(°)、22.5(°)、25.0(°)等處有特征衍射峰;γ-hy-CyD 在 8.8(°)、17.8(°)、20.5(°) 處有三個明顯的衍射峰，且峰形較寬，表明γ-hy-CyD為無定形結(jié)構(gòu);γ-hy-PC和γ-hy-PC/Ada-Dox都只有一個明顯的衍射峰，γ-hy-PC/Ada-Dox的衍射峰比 γ-hy-PC的更寬并有所位移，說明Ada-Dox已經(jīng)嵌入γ-hy-PC主體材料中形成了超分子結(jié)構(gòu)物，其無定型結(jié)構(gòu)更加明顯。

圖3c 為 Dox、Ada-Dox、γ-hy-CyD、γ-hy-PC和γ-hy-PC/Ada-Dox的熱重分析。由圖可知Dox的分解溫度為 193.7℃ 和 255.5℃，生成Ada-Dox后的分解溫度為144.4℃，說明生成物熱穩(wěn)定性較差;γ-hy-CyD的分解溫度為292.6℃，而偶聯(lián)PEI600后，分解溫度分別變?yōu)?38℃，再與Ada-Dox形成主客體材料后，分解溫度變?yōu)?55℃，這些變化說明材料的組分已經(jīng)發(fā)生改變，其穩(wěn)定性也發(fā)生了變化。

圖3d為 Dox、γ-hy-PC 和 γ-hy-PC/Ada-Dox的紫外吸收光譜。γ-hy-PC基本無紫外吸收譜帶，Dox在480 nm處有吸收峰，Ada-Dox與 γ-hy-PC形成了主客體超分子聚合物后，吸收峰移至508nm，位移向長波長方向移動了28 nm。這與形成超分子結(jié)構(gòu)后，共軛程度增加有關(guān)。根據(jù)阿霉素的標準吸收曲線(A=14.220C+0.008，R2=0.993)可以計算，所合成的兩種 γ-hy-PC/Ada-Dox的載藥量分別為 0.5%和5.5%。

圖2 超分子載體材料的核磁共振氫譜表征，其中Dox(a)、Ada-COOH(b)、Ada-Dox(c)、γ-hy-PC(d)和γ-hy-PC/Ada-Dox(e)Fig.2 1H-NMR spectra of Dox(a)，Ada-COOH(b)，Ada-Dox(c)，γ-hy-PC(d)and γ-hy-PC/Ada-Dox(e)

超分子材料和DNA形成的納米微球的粒徑和zeta電勢的大小，直接影響著體外轉(zhuǎn)染效率。圖4a、b分別為在不同的N/P比下PEI 25 kDa(N/P 為 10)、γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)的粒徑和zeta電勢。實驗結(jié)果表明 γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)與DNA在N/P為10～40之間的粒徑基本維持在100～300 nm之間，γ-hy-PC的粒徑均在180 nm 以下，而 γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)的粒徑為 200 nm以上，說明γ-hy-PC與Ada-Dox形成超分子化合物后粒徑明顯增大，對照組PEI 25 kDa(N/P為10)的粒徑則為350nm左右。從測得的zeta電勢 結(jié) 果 可 知 γ-hy-PC、 γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%) 與 DNA形成的微球在N/P 10～40之間時zeta電勢基本為維持在20～40 mV之間，均小于對照組PEI 25 kDa(N/P為10)的zeta電勢。

圖5 為 γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)與質(zhì)粒在不同N/P下的凝膠阻滯實驗。γ-hy-PC在N/P為2∶1時能完全結(jié)合DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)在N/P 為3∶1時能完全結(jié)合DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)在N/P為4∶1時能完全結(jié)合DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。實驗結(jié)果說明γ-hy-PC上嵌入Ada-Dox量增多，其結(jié)合DNA的能力減弱。

圖5 超分子載體材料對質(zhì)粒DNA的凝膠阻滯實驗，A、B、C分別為載體材料γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)Fig.5 A， B， C mean respectively，electrophoretic mobility shift assay ofγhy-PC/DNA， γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)/DNA and γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)/DNA

2.3 體外細胞毒性實驗結(jié)果 圖6為PEI 600 Da、PEI 25 kDa、γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)的細胞毒性實驗結(jié)果。從圖中可看出，PEI 600 Da在N/P為10～60范圍內(nèi)基本沒有毒性，PEI 25 kDa的毒性最大。三種材料在N/P為10～60范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的毒性，介于PEI 600 Da與PEI 25 kDa之間，在體外轉(zhuǎn)染N/P(30∶1)下，兩種細胞的存活率均高于60%。

圖6 PEI 600 Da、PEI 25 kDa、γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)的細胞毒性實驗Fig.6 Cytotoxicity of PEI 600 Da，PEI 25 kDa，γ-hy-PC，γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)and γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)in BEL-7402 and SMMC-7721

2.4 細胞遷移實驗結(jié)果 遷移是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中必不可少的環(huán)節(jié)，腫瘤細胞與母體瘤分離、穿越血管壁、侵襲周邊正常組織均需要一定的運動能力，高轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞通常具有較強的運動性。圖7 a、b分別為HEK293、BEL-7404細胞的劃痕照片;c、d分別為HEK293、BEL-7404細胞在24 h、48 h的細胞遷移率。經(jīng)過24 h后，在不加任何藥物的陰性對照組，細胞已經(jīng)向中間遷移，清晰的劃痕界面變得模糊，而加入材料的實驗組細胞遷移的數(shù)量明顯小于陰性對照組細胞遷移的數(shù)量，且γ-hy-PC/Ada-Dox的毒性要大于γ-hy-PC;但48h后γ-hy-PC/Ada-Dox的毒性與γ-hy-PC的差距沒有那么明顯，說明隨著時間的推移，由于材料毒性較高，細胞基本無存活。

2.5 H/E染色結(jié)果 圖8為在BEL-7402細胞上H/E染色實驗結(jié)果。從此實驗結(jié)果可看出，加入材料的細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，胞漿明顯減少，而且存在大量的細胞裂解物，說明材料對細胞有一定的毒性，且載藥量越大使細胞形態(tài)改變越大，對細胞的毒性越大。

2.6 體外轉(zhuǎn)染結(jié)果 實驗以HEK293細胞為研究對象，比較了 γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%)和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)載體材料的體外轉(zhuǎn)染效率，以PEI 600 Da和PEI 25 kDa作為對照組，圖 9a、b、c分別是 γ-hy-PC、γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%) 和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)材料在N/P為30時在HEK293細胞上的轉(zhuǎn)染圖片。從圖中可看出，載體γ-hy-PC的轉(zhuǎn)染效率較高，細胞呈現(xiàn)出較強的綠色熒光，而γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%) 和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)的轉(zhuǎn)染效率較低，且載藥量越大轉(zhuǎn)染效率越低。圖9d是在HEK293細胞上的轉(zhuǎn)染效率曲線，在N/P為10～35時γ-hy-PC的轉(zhuǎn)染率大于 γ-hy-PC/Ada-Dox(0.5%) 和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)，且載藥量越高轉(zhuǎn)染效率越低，這結(jié)果與綠色熒光的轉(zhuǎn)染結(jié)果一致。

2.7 細胞吞噬實驗結(jié)果 圖10是γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)材料吞噬 FAM-siRNA進入BEL-7402細胞的照片。從圖中可以看到Dox，包括結(jié)合的和已解離的Dox的紅色熒光，基本集中在核周圍，表明納米粒攜帶的藥物被細胞內(nèi)吞后，隨內(nèi)吞體/溶酶體逐漸向核移動，開始藥物釋放。FAM-siRNA被材料攜帶入細胞后，在細胞核周圍出現(xiàn)綠色熒光，表明載體材料可攜帶siRNA進入細胞。

3 討論

本實驗所合成的主客體載體材料γ-hy-PC是一種新型的非病毒載體，在合成γ-hy-PC時，為防止反應(yīng)產(chǎn)物之間發(fā)生交聯(lián)，需要調(diào)控PEI 600 Da的反應(yīng)量，在本實驗中γ-羥丙基環(huán)糊精與PEI 600 Da的摩爾比為1∶9，在PEI600滴加過程中需均勻攪拌緩慢滴加?？腕w材料Ada-Dox的投料量分別按理論值的1%、8%投料，而實際測定值為0.5%和5%，說明在反應(yīng)過程中有一定的損失。在主客體載體材料的表征中發(fā)現(xiàn)，客體的組裝比例直接影響整個載體材料的性質(zhì)。在微粒的粒徑方面，非病毒載體縮合DNA后可形成納米顆粒，其一般為幾百納米，通過內(nèi)吞途徑進入細胞，從粒徑測定的結(jié)果中可知，客體材料Ada-Dox的組裝比例對γ-hy-PC的粒徑大小有明顯的影響，Ada-Dox的比例增加，微粒的粒徑明顯增大，5%組裝的超分子材料在與DNA結(jié)合30∶1時其粒徑接近400 nm。在與DNA的結(jié)合能力方面，凝膠阻滯電泳結(jié)果顯示，客體Ada-Dox與主體γ-hy-PC的組裝比例提高，聚合物濃縮DNA的能力減小。

從細胞毒性試驗顯示，載體材料γ-hy-PC、γhy-PC/Ada-Dox(0.5%) 和 γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)均呈現(xiàn)出一定的毒性，隨著載藥量的增大，細胞毒性隨之增大，同樣的結(jié)果在細胞劃痕和H/E染色實驗中得到證明。

在體外轉(zhuǎn)染實驗中顯示，γ-hy-PC/Ada-Dox的轉(zhuǎn)染效率低于γ-hy-PC，且隨著載藥量的增大，轉(zhuǎn)染效率降低。我們認為阿霉素起了一定的作用，聚合物中阿霉素含量的增加，抑制pEGEP質(zhì)粒表達綠色熒光蛋白。細胞吞噬實驗表明γ-hy-PC/Ada-Dox(5.5%)可攜帶具有治療性的siRNA進入細胞。

綜上所述，實驗成功合成了γ-hy-PC/Ada-Dox主客體組裝的超分子材料，且該材料在藥物與基因協(xié)同治療中具有了潛在的應(yīng)用價值。

［1］ MARK E DAVIS.Non-viral gene delivery systems［J］.Curr Opin Biotech，2002，13:128-131.

［2］ HE CX，TABATA Y.GAO JQ，et al.Non-viral gene delivery carrier and its three-dimensional transfection system［J］.Int J of Pharm，2010，386:232-242.

［3］ NISHIKAWA M，HASHIDA M.Nonviral approaches satisfying various requirements for effective in vivo gene therapy［J］.Biol Pharm Bull，2002，25:275-283.

［4］ GAJADHAR B.SUSMITA M.AMARNATH M，et al.DNA encapsulated magnesium and manganous phosphate nanoparticles:potential non-viral vectors for gene delivery［J］.Biomaterials，2005，26:2157-2163.

［5］ CHEN L，ZHU X Y，YAO Y F，et al.Controlling Polymer Architecture through Host Guest Interactions［J］.Angew Chem Int Ed，2006，45:87-90.

［6］ ZHANG J X，SUN H L，PETER.X.MA.Host-guest Interactions Mediated Polymeric Assemblies:Multifunctional Nanoparticles for Drug and Gene Delivery［J］.ACSNano，2010，4:1049-1059.

［7］ LI Y，JI L，HE B，etal.Study on the α-cyclodextrin/poly(ethylene glycol)self-assembly supramolecular nanoparticles for drug delivery［J］.Chem Scichina，2010，40(3):247-254.

［8］ LI SJ，LIANG H Y，WANG X L.A supramolecular system obtained by cyclodentrin dimmers with adamantly modified polyacrylamide ［J］.Fine Chemicals，2012，29(6):531-536.

［9］ HU Q D，F(xiàn)AN H，TANG G P，et al.Cationic supramolecular nanoparticles for co-delivery of gene and anticancer drug［J］.Chem Commun，2011，47:5572-5574.

［10］ ZHANG Z Y，UGWU S，ZHANG A，et al.A novel cationic cardiolipin analogue for gene delivery［J］.Pharmazie，2006，61(1):10-14.

［11］ HUH SH，DO H J，LIM H J，et al.Optimization of 25kD linear polyethylenimine for effieient gene delivery［J］.Biologicals，2007，35:165-171.

Synthesis of a supermolecular nanoparticleγ-hy-PC/Ada-Dox and its antitumor activity

LI Yong-bin1，WANG Kai1，HU Tian-nan1，WANG Qi-wen1，HU Qi-da1，ZHOU Jun1，HU Xiu-rong2，TANG Gu-ping1
(1.Institute of Chemical Biology and Pharmaceutical Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310028，China;2.Center of Analysis and Measurement，Zhejiang University，Hangzhou 310028，China)

Objective: To synthesize a (2-Hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin-polyethylenimine/adamantane-conjugated doxorubicin(γ-hy-PC/Ada-Dox)based supramolecular nanoparticle with host-guest interaction and to identify its physicochemical characterizations and antitumor effect.Methods:A novel non-viral gene delivery vector γ-hy-PC/Ada-Dox was synthesized based on host-guest interaction.1H-NMR，NOESY，UV-Vis，XRD and TGA were used to confirm the structure of the vector.The DNA condensing ability of complexes was investigated by particle size，zeta potential and gel retardation assay.Cytotoxicity of complexes was determined by MTT assay in BEL-7402 and SMMC-7721 cells.Cell wound healing assay was performed in HEK293 and BEL-7404 cells.The transfection efficiency was investigated in HEK293 cells.H/E staining and cell uptake assay was performed in BEL-7402 cells.Results:The structure ofγ-hy-PC/Ada-Dox was characterized by1H-NMR，NOESY，UV-Vis，XRD，TGA.The drug loading was 0.5%and 5.5%.Gel retardation assay showed that γ-hy-PC was able to completely condense DNA at N/P ratio of 2;0.5%and 5.5% γ-hy-PC/Ada-Dox was able to completely condense DNA at N/Pratio of 3 and 4，respectively.The cytotoxicity of polymers was lower than that of PEI25KDa.The transfection efficiency ofγ-hy-PC was higher than that ofγ-hy-PC/Ada-Dox at N/P ratio of 30 in HEK293 cells;and the transfection efficiency was decreasing when Ada-Dox loading was increasing.Cell uptake assay showed that γ-hy-PC/Ada-Dox was able to carry drug and FAM-siRNA into cells.Conclusion:The novel vector γ-hy-PC/Ada-Dox has been developed successfully，which has certain transfection efficiency and antitumor activity.

Doxorubicin/analogs＆ derivatives;Doxorubicin/pharmacology;Antineoplastic drugs/pharmacology;(2-Hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin; Polyethyleneimine; Doxorubicin;Nanoparticles carrier

R 730.54

A

1008-9292(2012)06-0599-11

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.002

2012-09-07

2012-10-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(30970711，21074111).

李永斌(1988-)，男，碩士研究生，化學(xué)生物學(xué)專業(yè).

湯谷平(1961-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物材料、藥物的控制釋放和基因治療等;E-mail:tangguping@zju.edu.cn

［責(zé)任編輯 張榮連］