姚 祺，金 雪，胡天楠，王啟聞，王訓(xùn)師，胡奇達(dá)，徐 桑，周 峻，湯谷平

四種聚陽離子載體材料的體外細(xì)胞學(xué)及體內(nèi)性質(zhì)研究

姚 祺，金 雪，胡天楠，王啟聞，王訓(xùn)師，胡奇達(dá)，徐 桑，周 峻，湯谷平

(浙江大學(xué)化學(xué)生物和藥物研究所，浙江杭州310028)

目的：對四種非病毒型聚陽離子載體材料的理化性質(zhì)、體外細(xì)胞學(xué)及體內(nèi)性質(zhì)進(jìn)行研究。方法：合成聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(PEI-CyD)、聚乙烯亞胺-聚天冬酰胺(PEI-PHPA)和烷基胺-聚天冬酰胺(PEE-PHPA)等三種聚陽離子材料，用1H核磁共振對載體材料的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定;凝膠電泳實驗研究了載體材料對質(zhì)粒DNA的濃縮能力;粒徑分析儀測定了載體材料結(jié)合DNA后的粒徑及表面電荷。用MTT法在COS-7、A549、HEK-293和C6等細(xì)胞株上測定了四種載體材料的細(xì)胞毒性;在HEK-293細(xì)胞株上進(jìn)行了體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。進(jìn)行了四種載體材料體內(nèi)毒性、組織分布和體內(nèi)攜帶報告基因轉(zhuǎn)染實驗。結(jié)果：1H核磁共振證實了它們的結(jié)構(gòu)。在N/P小于40時，載體材料的平均粒徑在100～250 nm，表面電荷在10～35 mV，適合體外細(xì)胞的吞噬。體外細(xì)胞毒性表明，PEE-PHPA 在 C6、COS-7、A549和 HEK293 細(xì)胞上的 IC50 值分別為21.5、20.2、7.30 和 37.1 μg/ml，PEI 25 kD 的 IC50 值分別為15.8、18.3、11.4 和36.7 μg/ml，PEI-CyD 和 PEI-PHPA 在實驗所測定的濃度范圍中，細(xì)胞的存活率高于60%。四種聚陽離子材料都具有較強的DNA縮合能力，且有較好的體外基因轉(zhuǎn)染能力。體內(nèi)急性毒性實驗表明，PEI-PHPA、PEE-PHPA載體材料為低毒性載體材料，其LD50值大于500 mg/kg，血項指標(biāo)表明PEE-PHPA載體材料對肝、腎功能有輕微影響，體內(nèi)分布顯示，四種聚陽離子載體材料在腎富集較高。結(jié)論：PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA聚陽離子載體材料均有較好的體外基因轉(zhuǎn)染能力，能夠攜帶報告基因在體內(nèi)表達(dá)，其中PEI-CyD和PEE-PHPA是具有應(yīng)用前景的非病毒性基因藥物載體。

陽離子;聚合物;遺傳載體;環(huán)糊精類/化學(xué);聚乙烯亞胺/化學(xué);聚陽離子材料;體外實驗;體內(nèi)實驗

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):620-630.］

非病毒藥物載體在藥物、基因的輸送中具有重要的作用。經(jīng)過多年的研究，證明其在藥物輸送的靶向性、安全性以及載藥特性等方面均顯示出良好的性能［1］。其中，聚陽離子材料具有無免疫原性，不引起機體的免疫反應(yīng)、通過調(diào)控納米尺寸和表面性質(zhì)可控制其生理行為、經(jīng)過靶向修飾，可實現(xiàn)藥物和基因的定向釋放等［2，3］特點，在非病毒藥物載體中獨樹一幟。在藥物和基因的攜帶過程中，聚陽離子材料表面的正電荷，通過靜電作用可以濃縮DNAs或RNAs形成納米微球［4］，帶正電荷的納米微球易于粘附于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面，以細(xì)胞內(nèi)吞或受配體結(jié)合等方式進(jìn)入細(xì)胞，并將藥物或基團(tuán)帶入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)部遷移的過程中，其獨特的“質(zhì)子緩沖效應(yīng)”可以保護(hù) DNAs或RNAs免受溶酶體的侵蝕和降解，以達(dá)到輸送藥物的目的［5-7］。但是，在研究中發(fā)現(xiàn)，聚陽離子材料也存在著某些缺陷與問題，如過量的正電荷會造成輸送體系的溶血和栓塞，聚陽離子的非生物降解性、體內(nèi)代謝較慢以及轉(zhuǎn)染效率較低等問題，使其難以在實驗及臨床研究中得到廣泛應(yīng)用［8-10］。

針對這些問題，本論文以聚乙烯亞胺(PEI 25 kD)、聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(PEI-CyD)、聚乙烯亞胺-聚天冬酰胺(PEI-PHPA)和烷基胺-聚天冬酰胺(PEE-PHPA)等四種聚陽離子材料為研究對象，對所合成的三種載體材料進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)評價，著重對載體材料進(jìn)入體內(nèi)后對生物體血相指標(biāo)的影響，其在體內(nèi)分布、毒性等作了研究，為載體材料的深入研究提供了科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 聚乙烯亞胺(branch polyethylenimine，PEI，分子量分別為25 kDa 和600)，天冬氨酸，購自 Sigma-Aldrich公司，β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CyD，MW=1135)，熒光素鈉(分子量為376.27)購自 Sigma公司，N，N'-羰基二咪唑(1，1'-Carbonyldiimidazole，CDI，Mw=162.15)購自 Pierce公司，N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF，Sigma)3，3'-二氨基二丙基胺(Bis(3-aminopropyl)amine，98%，Aldrich)。螢火蟲熒光素酶真核表達(dá)質(zhì)粒pGL-4，購自 Promega公司。COS-7、A549、HEK293和C6細(xì)胞系由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所提供。ICR小鼠購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 材料的合成 聚乙烯亞胺-環(huán)糊精(PEI-CyD)的合成:稱取 β-CyD(2.2 g，1.85 mmol)溶于10 ml DMSO，取N，N'-羰基二咪唑CDI(2.5 g，14.8 mmol)溶于10 ml DMSO，于50 ml圓底燒瓶中，氮氣保護(hù)、避光條件下攪拌反應(yīng) 3 h。稱取 PEI 600(6.8 g，11.5 mmol)，溶于15 ml DMSO，滴加到上述反應(yīng)溶液中，反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液經(jīng)Mw 8 000～14 000 Da透析膜透析，用流動純水透析48 h。透析結(jié)束后，冷凍干燥至干，得到白色絮狀固體。

聚乙烯亞胺-聚羥丙基天冬酰胺的合成(PEI-PHPA):稱取 PHPA(0.5 g，2.92 mmol)溶于6 ml DMSO加入50 ml圓底燒瓶中，加入0.2 ml三乙胺(Et3N)作為催化劑，另取CDI(0.7 g，4.32 mmol)溶于 2.5 ml DMSO，在20 ℃條件下加入反應(yīng)體系，在氮氣保護(hù)避光條件下持續(xù)攪拌反應(yīng) 3 h。取 PEI 600 Da(1.85 g，3.07 mmol)溶于6 ml DMSO，逐滴加入到活化的PHPA溶液中，氮氣保護(hù)條件下避光反應(yīng)過夜。將反應(yīng)完的溶液轉(zhuǎn)移入透析袋(Mw:8 000～14 400 Da)中，用流動的純水透析48 h。透析完畢后，冰凍干燥，得到白色絮狀固體。

烷基胺-聚天冬氨酸(PEE-PHPA)的合成:稱取聚琥珀酰亞胺(PSI)(1 g，10 mmol)于15 ml N，N-二甲基甲酰胺中，加熱使充分溶解，保持水浴，依次慢慢滴加二甲基二丙烯三胺和3，3'-二氨基二丙基胺，二甲基二丙烯三胺和3，3'-二氨基二丙基胺的總量控制在25 mmol，二者依次分別與PSI反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用透析袋(Mw=8000～14000 Da)，用流動的純水透析48 h，透析完畢后，冰凍干燥，得到白色絮狀固體。

熒光素納-聚乙烯亞胺-聚羥丙基天冬酰胺(Flu-PEI-PHPA)的合成:稱取2.8 mg熒光素鈉(7.5 mmol)于10 ml DMSO 中，稱取 0.7 g CDI(4.32 mmol)于2 ml DMSO中，與上述體系反應(yīng)3 h，再加入PEI-PHPA 3.5 mg在氮氣保護(hù)下暗處反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用透析袋(Mw=8000-14000Da)，用流動的純水透析48 h，透析完畢后，冰凍干燥，得到紅色絮狀固體。其余三種載體材料的熒光素鈉復(fù)合物的合成方法同上，產(chǎn)品經(jīng)過1H NMR鑒定，熒光素鈉的接入率為2.5%。經(jīng)過高效液相色譜測定熒光素鈉的純度。

1.2.2 核磁共振氫譜(1H-NMR) 分別取以上三種合成載體材料和PEI 25 kD 5 mg，溶于0.5 ml D2O中，溶解后裝入核磁管中，室溫下用核磁共振儀測定。

1.2.3 粒徑和表面電荷測定 將載體材料用雙蒸水配制成1 mg/ml的溶液，將PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD和PEI 25 kD四種載體材料配置成350μg/μl;制備方法是:先分別將PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和 PEI 25 kD與DNA混合放置30 min。用pH 7.4的PBS溶液稀釋至1.5 ml。用Zetasizer測定粒徑和表面電荷。每份樣品測定6次，每次50 s，得出6個數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.4 分子量的測定(GPC) 分別將 PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和 PEI 25 kD 四種載體材料5 mg溶解于1ml雙蒸水中。色譜條件:以葡聚糖(12 000 Da，50 000 Da，80 000 Da，150 000 Da，670 000 Da)作為對照品，檢測條件:Waters 515型凝膠色譜儀;Waters 2410示差折光檢測器;TOSOH TSK-GEL G4000PWXL柱子(Janpan);色譜條件:柱溫40℃，流速 0.8 ml/min，流動相 0.3 M NaAc(用醋酸調(diào)至 pH 4.44)，進(jìn)樣量:50 μl。

1.2.5 脂糖凝膠電泳阻滯實驗 電泳條件:1×TAE緩沖液，電壓100 mV，電泳時間為40 min。在紫外燈下觀察拍照，確定載體材料與結(jié)合阻滯質(zhì)粒DNA的N/P比。將材料與質(zhì)粒(1 μg)按照不同的 N/P=0∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，以pH7.4的PBS作為溶劑分別配制總體積為10μl的載體材料溶液與DNA溶液。混勻，靜置30 min備用。

1.2.6 MTT細(xì)胞毒性實驗 將 COS-7、A549和HEK-293及C6細(xì)胞接種于96孔板上(1×104個/孔)，孵育16 h，移去培養(yǎng)液，每孔加入預(yù)先配制好的一系列濃度的待測的四種材料的無血清培養(yǎng)液。孵育4 h后，移去培養(yǎng)液，加入90 μl無血清DMEM培養(yǎng)液和10μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育3 h。翻板法除去培養(yǎng)液，加入100μl DMSO，振蕩10 min后，在570 nm處用酶標(biāo)儀測定其OD值。細(xì)胞活力的計算式∶細(xì)胞活力=(每孔樣品OD值-每孔陽性O(shè)D平均值)/(每孔空白組OD平均值-每孔陽性O(shè)D平均值)×100%。

1.2.7 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 按每孔3×104個細(xì)胞(HEK293)每孔加10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液500μl，37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育16 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。每孔質(zhì)粒用量為2μg，每孔加入濃度(N/P為20)的化合物PEI-PHPA、PEEPHPA、PEI-CyD溶液和PEI 25 kD的N/P比為10，用無血清DMEM培養(yǎng)液配制，每孔液體體積為500μl。孵育4h后，輕輕吸去培養(yǎng)液，每孔加入500μl 10%牛血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h以觀察。

1.2.8 生化指標(biāo)檢測 分別將四種材料PEI 25 kD、PEI-PHPA、PEE-PHPA 和 PEI-CyD(1 mg/ml，0.2 ml)腹腔注射入 ICR 小鼠，平均每種材料注射3只小鼠，每隔1天注射1次，共注射4次。在最后一次注射完后撤去實物，12 h后進(jìn)行眼眶取血，取約2 ml血樣分別放入裝有5μl肝素鈉(防止凝血)的試管中。將試管密封送到浙江大學(xué)西溪校區(qū)醫(yī)務(wù)室進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。

1.2.9 急性毒性試驗ICR小鼠(18～20 g)100只，隨機分成10組，(每組雌雄各5只，共10只小鼠)，腹腔注射給藥，給藥前禁食8 h(提供飲水)，給藥后觀察14 h。記錄小鼠生存情況。4種材料共400只小鼠。

1.2.10 載體材料體內(nèi)分布實驗 ICR小鼠(18～20 g)20只，隨機分成4組(每組5只)，尾靜脈注射載體材料，載體材料為用熒光標(biāo)記的4種載體材料，給藥24 h后，處死小鼠，取出器官(心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺)稱重，加入PBS勻漿，將勻漿液離心，取上清，用HPLC方法測定五個組織器官中熒光素的含量。色譜條件為:色譜柱(25 cm，C18)，流動相為乙睛∶水為7∶3，流速:0.5 ml/min，檢測波長:238 nm。

1.2.11 載體材料攜帶報告基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗ICR小鼠(18～20 g)20只，隨機分成4組(每組5只小鼠)，尾靜脈注射:載體材料/pGL4-luc(50μg質(zhì)粒 DNA，N/P=30/1)。48 h后，處死小鼠，取出器官(心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺)稱重，加入PBS勻漿，將勻漿液離心，取上清，測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 載體材料的性質(zhì)表征 圖1是烷基胺-聚天冬酰胺(PEE-PHPA)的合成路線，聚乙烯亞胺(600)-環(huán)糊精(PEI-CyD)［11］、聚乙烯亞胺(600)-聚天冬酰胺(PEI-PHPA)［12］的合成路線已曾報道。圖2是四種載體材料的氫核磁共振圖譜，其中圖2a為PEI 25 kD的核磁共振圖，圖中化學(xué)位移為 2.5 ～3.0 為-NHCH2CH2-基團(tuán)的特征吸收峰;圖2b為PEI-CyD的核磁共振圖，化學(xué)位移為3.3 ～4.0、5.0 為 β-CyD 的特征吸收峰。圖2c為PEE-PHPA的核磁譜圖;圖2d為 PEI-PHPA的核磁譜圖，化學(xué)位移為4.55、3.45 ～ 3.52、3.09 ～ 3.19、1.58 ～ 1.70 的特征吸收峰。

圖1 PEE-PHPA的合成路線Fig.1 Synthesis route of PEE-PHPA

圖2 PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA的1H核磁共振譜圖Fig.2 1 HMNR spectra of PEI 25 kD，PEI-CyD，PEE-PHPA，PHPA-PEI

表1是用凝膠色譜(GPC)測定的PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA四種聚陽離子載體材料的分子量、粒徑和表面電荷值。由表所知四種載體材料的分子量在30～40 kD。

表1 PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA、PEIPHPA四種載體材料的性質(zhì)Table 1 Characteristics of cationic polymers PEI 25 kD，PEI-CyD，PEE-PHPA and PEI-PHPA

在粒徑和表面電荷的測定中PEI 25 kD是其與 DNA的 N/P比例為10測定，PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA三種聚陽離子載體材料是其與DNA的N/P比例為30時測得。

圖3是PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA 和PEI-PHPA四種聚陽離子載體材料的凝膠電泳阻滯實驗及PEI-PHPA/DNA微粒在30:1時的粒徑分布和表面電荷分布曲線。由圖3a所示，四種聚陽離子載體材料均可以很好的綁定DNA。圖中0～5泳道所對應(yīng)的聚陽離子載體/pDNA 的 N/P 比值分別是 0，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1。從圖中可得，PHPA-PEI、PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI 25 kD分別在N/P比值為4∶1、1∶1、3∶1和3∶1時完全阻滯 DNA 的遷移。圖3b、3c分別為PEI-PHPA載體材料的粒徑和表面電荷的曲線，曲線分布呈正態(tài)分布，在PEI-PHPA/DNA為30∶1時，其粒徑約為220 nm，zeta電位值約為32 mV，較適宜于細(xì)胞的吞噬及體內(nèi)外基因的轉(zhuǎn)染。

2.2 載體材料的體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果 圖4是 PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA 和 PEI-PHPA四種載體材料在 COS-7、A549、C6和HEK293細(xì)胞株上的毒性實驗結(jié)果。由圖可知，PEE-PHPA和PEI 25 kD的細(xì)胞毒性較大，其中PEE-PHPA在C6、COS-7、A549和HEK293細(xì)胞上的 IC50 值分別為 21.5、20.2、7.30 和37.1 μg/ml，PEI 25 kD 的 IC50 值分別為15.8、18.3、11.4 和 36.7 μg/ml。PEI-CyD 和 PEI-PHPA細(xì)胞毒性相對較小，在實驗所測定的濃度范圍中，細(xì)胞的存活率高于60%。

圖5是PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA 和PEI-PHPA四種載體材料攜帶pEGFP質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染照片。PEI-PHPA、PEE-PHPA、PEI-CyD與pEGFP質(zhì)粒按最佳N/P比30形成的復(fù)合物，PEI 25 kD與DNA的比例為10。從圖中可看出，四種載體材料在HEK293細(xì)胞上均有較好的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 體內(nèi)急性毒性實驗結(jié)果 表2為PEI-CyD、PEE-PHPA、PEI-PHPA 和 PEI 25 kD 四種載體材料在ICR小鼠上的急性毒性實驗結(jié)果，載體材料經(jīng)配制成一定濃度后，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)觀察14天，觀測小鼠體重、毛色及死亡情況等并計算LD50結(jié)果。

從表2中可知PEI 25 Da和PEI600材料的腹腔注射的急性毒性值均小于50 mg/kg，為中等毒性，而PEI-PHPA和PEE-PHPA材料的腹腔注射的急性毒性值超過500 mg/kg，為低毒材料。PEI-CyD材料介于其中。

圖4 PEI-CyD、PEE-PHPA、PEI-PHPA 和 PEI 25 kD 四種材料在 COS-7、A549、HEK293、C6 細(xì)胞上的毒性實驗Fig.4 Cytotoxicity assay of PEI-CyD，PEE-PHPA，PEI-PHPA and PEI 25 kD in COS-7，A549，HEK293 and C6 cell lines

2.4 載體材料生化指標(biāo)檢測結(jié)果 圖6是PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA 和 PEI-PHPA四種聚陽離子載體材料經(jīng)腹腔注射于ICR小鼠48 h后，對其生化指標(biāo)的檢測的檢測結(jié)果，其中前7幅是肝組織的生化指標(biāo)，主要有總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、白球比值(A/G)、總膽紅素(TBIL)、丙谷轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量變化。由圖可知四種材料的肝指標(biāo)中的總蛋白、白蛋白、球蛋白和白球比值變化不明顯，與對照組相比丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的指標(biāo)有一定程度升高，表明存在進(jìn)行性的肝壞死，其中以PEI-CyD和PEE-HPHA的值變化較大，表明其對肝組織有一定的損傷。最后2幅為腎臟的檢測指標(biāo)，主要檢測肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的指標(biāo)變化。

2.5 病理切片分析 圖7是PEI 25 kD、PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA四種載體材料經(jīng)過腹腔注射后肝、腎和心臟組織的病理切片照片。由病理切片發(fā)現(xiàn)，注射PEE-PHPA材料的組織切片中，肝出現(xiàn)單個肝細(xì)胞壞死和形成雙核及多核肝細(xì)胞，但心臟和腎未見明顯病變，證明PEE-PHPA材料對肝臟有一定的的毒性;注射PEI-PHPA材料的組織切片中發(fā)現(xiàn)，在動物的肝臟出現(xiàn)部分炎癥，中央靜脈周圍肝細(xì)胞空泡變性，但心臟和腎未見明顯病變，表明其對肝有一定毒性，但是比PEE-PHPA影響小;注射PEI-CyD材料的組織切片中發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞水腫，肝和心臟未見明顯病變，證明它對腎臟有一定的影響，但對肝臟幾乎無毒。而注射PEI 25 kD的材料在本次試驗中對肝、腎和心臟所引起的影響較小。

2.6 載體材料體內(nèi)分布測定結(jié)果 表3是PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和 PEI 25 kD四種載體材料接入熒光素鈉后，尾靜脈注射載體材料，給藥48 h后對其肝腎、胰、心臟和肺組織的載體材料分布結(jié)果。熒光素鈉用高效液相色譜進(jìn)行檢測。從結(jié)果來看PEI 25 kD在肺部的濃度較大，從動物解剖發(fā)現(xiàn)，在肺部出現(xiàn)出血斑點及凝聚物，同樣的現(xiàn)象在PEE-PHPA的實驗小鼠上也觀察到，而PEI-CyD和PEI-PHPA材料則在腎和胰組織中濃度較大。

表3 PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和 PEI 25 kD載體材料的在ICR小鼠的體內(nèi)分布結(jié)果(μg/mg組織)Table 3 Distribution of PEE-PHPA，PEI-PHPA，PEI-CyD and PEI 25 kD in vivo

圖7 PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD和PEI 25 kD四種材料在體內(nèi)的病理切片F(xiàn)ig.7 Tissue slice of PEE-PHPA，PEI-PHPA，PEI-CyD and PEI 25 kD

2.7 載體材料攜帶報告基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果 圖8為 PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和PEI 25 kD四種載體材料攜帶PGL4-luc報告基因經(jīng)過尾靜脈注射在小鼠體內(nèi)48 h后的實驗結(jié)果。由圖8可知，四種載體材料攜帶報告基因在肝、心臟、脾、腎、肺均有一定表達(dá)，從濃度上看PEE-PHPA在脾臟表達(dá)較多，PEI-CyD在肝和心臟的表達(dá)較高。

圖8 PEE-PHPA、PEI-PHPA、PEI-CyD 和 PEI 25 kD攜帶質(zhì)粒pGL-4在體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.8 The transfection efficiency of cationic polymers/pGL-4 in vivo

3 討論

以分子量為25 kD的聚乙烯亞胺是聚陽離子材料的典型，也是研究較多的非病毒基因藥物載體，其特點是轉(zhuǎn)染效率與分子量相關(guān)，分子量越大，轉(zhuǎn)染效率也高，但是毒性也大。聚乙烯亞胺結(jié)構(gòu)中的三種氨基的比例是緩沖效果能力強、轉(zhuǎn)染效率高的重要因素，其結(jié)構(gòu)中的一級、二級和三級胺的比例為1∶2∶1，可以在兩種PH環(huán)境中形成較大的緩沖能力，所以在細(xì)胞的胞漿中可以發(fā)揮“海綿質(zhì)子效應(yīng)”。但是，聚乙烯亞胺最大的問題是非生物降解性及較高的陽離子電荷，因此，阻礙了其進(jìn)一步的廣泛使用。已經(jīng)有多個研究小組對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改性，低分子量的聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染效率低，但毒性也低且易于被生物代謝，因此，研究者用各種方法將低分子量的聚乙烯亞胺進(jìn)行交聯(lián)，增加分子量，提高轉(zhuǎn)染效率，同時保持較低的細(xì)胞毒性。在本研究中用環(huán)糊精與低分子量的聚乙烯亞胺交聯(lián)制成PEI-CyD載體材料，用聚天冬酰胺為母體，用低分子量的聚乙烯亞胺作為側(cè)基制成PEI-PHPA載體材料，均具有較好的基因轉(zhuǎn)染效率，同時細(xì)胞毒性也較低。在此基礎(chǔ)上，課題組首次用模擬聚乙烯亞胺的氨基比例的方法，以聚天冬酰胺為母體，側(cè)基用不同比例的烷基胺鍵合制成新型的聚陽離子載體材料PEE-PHPA。研究用1H核磁共振法對所設(shè)計合成的載體材料進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，在PEI-CyD結(jié)構(gòu)中，經(jīng)核磁共振譜中質(zhì)子峰的計算，聚乙烯亞胺與環(huán)糊精的摩爾比為1∶1，故為一線性結(jié)構(gòu)聚合物;在PEI-PHPA結(jié)構(gòu)中，根據(jù)核磁共振計算在PEIPHPA結(jié)構(gòu)中，每10個聚氨基酸單元結(jié)構(gòu)中接入4個PEI。在PEE-PHPA聚合物中，根據(jù)核磁共振和元素分析(數(shù)據(jù)未報導(dǎo))，其-N=，-NH-，NH2三種結(jié)構(gòu)的胺基的比例近似為1∶2∶1，與聚乙烯亞胺中胺基的比例非常接近，為形成良好的“質(zhì)子緩沖效應(yīng)”提供了可能。

研究對四種聚陽離子載體材料的體外生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，表明它們在結(jié)合DNA能力及基因轉(zhuǎn)效率上均表現(xiàn)出較好的性能。在細(xì)胞毒性實驗中PEI-CyD和PEI-PHPA的毒性較低，但PEE-PHPA的細(xì)胞毒性幾乎與PEI 25 kD相近，這與PEE-PHPA結(jié)構(gòu)中表面氨基較多有關(guān)。

在體內(nèi)動物學(xué)實驗中，通過腹腔注射后血項指標(biāo)和組織的病理切片觀察，四種載體材料對肝指標(biāo)的影響，包括總蛋白、白蛋白、球蛋白和白球比值變化不明顯，但是在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的指標(biāo)上與對照組相比有一定程度升高，表明存在進(jìn)行性的肝壞死，其中以PEE-HPHA的值變化較大，表明其對肝組織有一定的損傷。在腎功能指標(biāo)中，PEE-PHPA載體材料所引起的肌酐和尿素氮的變化最明顯。在載體材料的急性毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，聚乙烯亞胺(分子量為25kD和600)均表現(xiàn)為一定的毒性LD50值低于50 mg/kg，為中毒化合物。低分子量的聚乙烯亞胺偶合于環(huán)糊精上后，毒性有所降低。以聚天冬氨酸為母體的載體材料其毒性均比上述三種材料要低，PEI-PHPA和PEE-PHPA的LD50值均高于500 mg/kg，為低毒性化合物，PEE-PHPA聚合物在細(xì)胞學(xué)實驗和血項指標(biāo)中均顯示毒性，但LD50值卻較大，在用熒光素鈉標(biāo)記的載體材料體內(nèi)分布實驗中也發(fā)現(xiàn)PEE-PHPA的含量較其他器官要高(5.81μg/mg組織)，我們認(rèn)為這與其可生物降解有關(guān)，在相關(guān)的降解實驗中發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未報導(dǎo))，其能較快地被降解代謝，這在血項分析中腎指標(biāo)變化較大也得以證實，其代謝過程中陽離子胺基對器官組織的損傷有一定的聯(lián)系。在載體材料的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染實驗中PEE-PHPA也表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效率，特別是其在心臟的富集較低，主要集中于代謝途徑的器官，是一種潛在的藥物-基因輸送載體，相關(guān)的修飾和改性工作在進(jìn)一步進(jìn)行中。

4 結(jié)論

本研究對 PEI-CyD、PEE-PHPA、PEI-PHPA和PEI 25 kD四種聚陽離子載體材料的化學(xué)和生物學(xué)特征進(jìn)行了研究。實驗表明，所合成的聚陽離子材料三種聚陽離子載體材料均有較好的體外基因轉(zhuǎn)染能力。在體內(nèi)研究中三種載體的毒性均低于PEI 25 kD，且能夠攜帶報告基因在體內(nèi)表達(dá)，其中PEI-CyD和PEE-PHPA是具有應(yīng)用前景的非病毒性基因藥物載體。

(病理切片由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理實驗室朱有法老師完成，急性毒性實驗由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實驗室唐法娣教授課題組完成，特此致謝。)

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Characteristics of cationic polymers PEI-CyD，PEI-PHPA，PEE-PHPA and PEI25kD in vitro and in vivo

YAO Qi，JIN Xue，HU Tian-nan，WANG Qi-wen，WANG Xun-shi，HU Qi-da，XU Sang，ZHOU Jun，TANG Gu-ping
(Institute of Chemical Biology and Pharmaceutical Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310028，China)

Objective:To study the charicteristics of cationic polymers polyethylenimine-β-cyclodextrin(PEI-CyD)，polyethylenimine-poly-(3-hydroxypropyl)-aspartamide(PEI-PHPA)，N，N-Dimethyldipropylenetriamine-Bis(3-aminopropyl)amine-aspartamide(PEE-PHPA)in vitro and in vivo.Methods:PEI-PHPA，PEI-CyD and PEE-PHPA were synthesized and the chemistry structure of PEI-PHPA，PEI-CyD and PEE-PHPA was confirmed by1H-NMR.The particle size and zeta potential of these polymers were measured，and capacity of plasmid DNA condensation was tested.The inhibition of COS-7，A549，HEK293 and C6 cells was measured by MTT assay.The transfection efficiency was determined in HEK293 cell lines.The toxicity，tissue distribution and transfection efficiency of cationic polymers were tested in vivo.Results:When the N/Pof polymers/DNA at 30，the particle sizes were close 250 nm and the zeta-potential were near 35 mv.They were able to condense DNA at N/P ratio ＜ 5.The MTT assay showed that the IC50of PEE-PHPA was 21.5，20.2，7.30 and 37.1 μg/ml，and that of PEI25kD was 15.8，18.3，11.4 and 36.7 μg/ml in C6，COS-7，A549 and HEK293cell lines，respectively.The cell viability of PEI-CyD and PEI-PHPA in above cell lines was over 60%.They had high transfection efficiency in HEK293 cell lines.The LD50of PEI25Kd，PEI-CyD，PEI-PHPA and PEE-PHPA in vivo was 19.50，100.4，521.2 and 630.0，respectively by intraperitoneal(ip)injection.The contractions of these polymers were higher in kidney than in other organs and tissues.PEE-PHPA had slight effect on kidney and liver function.Conclusion:PEE and PEI25kD have higher transfection efficiency and higher toxicity;while PC and PHPA-PEI have lower toxicity and higher transfection efficiency to be used as non-viral gene vector.

Cations;Polymers;Genetic vectors;Cyclodextrin/chemistry;Polyethyleneimine/chemitry;Polycation;In vitro;In vivo

R 730.54

A

1008-9292(2012)06-0620-11

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.004

2012-09-07

2012-10-08

國家自然科學(xué)基金項目資助項目(30970711，21074111).

姚 祺(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:化學(xué)生物學(xué).

湯谷平(1961-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物材料、藥物的控制釋放和基因治療等;E-mail:tangguping@zju.edu.cn

［責(zé)任編輯 張榮連］