黃守國，秦杰，陳瑾，程虹，蒙秋，張靜，王海燕

目前對腫瘤相關基因的研究已從腫瘤發(fā)生機制向轉移機制方向發(fā)展。某些原癌基因及抑癌基因不僅在腫瘤發(fā)生中起重要作用，且在腫瘤轉移過程中也有一定影響。癌基因的激活與抑癌基因的失活均可使細胞生長與分化的調(diào)節(jié)失控，導致細胞持續(xù)分裂和癌變。惡性腫瘤的侵襲和轉移是衡量其惡性程度的主要因素，是一個由多基因控制的、受多因素影響的、多階段多步驟的復雜過程，涉及癌細胞異常的增殖、黏附、遷移，細胞外基質(zhì)降解及血管生成等一系列病理生理活動。已有大量的試驗證明腫瘤的發(fā)生和轉移與多種控制細胞周期和細胞增殖轉移基因的表達失調(diào)相關［1-4］。為了解控制細胞周期和細胞增殖轉移基因對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖轉移的影響，本研究利用實時熒光定量RT-PCR技術檢測子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織標本中 N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1基因的表達情況，并進行對比分析，以期在基因水平探討子宮內(nèi)膜癌細胞增殖轉移的本質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例標本取自我院婦科2009年1月至2011年1月的住院患者，年齡25～65歲，平均年齡(47.38±12.35)歲。其中，非子宮內(nèi)膜癌患者正常子宮內(nèi)膜組織30例，子宮內(nèi)膜癌患者(均經(jīng)病理確診)子宮內(nèi)膜癌組織60例，根據(jù)術后病理檢查是否有子宮外轉移分為轉移組和未轉移組各30例，均取活體新鮮組織于－80℃冰箱保存?；颊呤中g前均未進行化療、放療、生物治療等其他治療，排除其他系統(tǒng)合并癥及其他系統(tǒng)腫瘤等。

1.2 主要儀器與試劑 MJ OPTICON2型熒光PCR儀(BIO-RAD，美國);Taq酶(TAKARA，日本);ReverTra Ace-α-反轉錄試劑盒(TOYOBO，日本);PCR擴增引物:N-myc、Fas、MTA1、nm23-H1 及 β-actin 的mRNA由上海英駿生物技術有限公司合成，設計引物探針所用軟件為Primer express 2.0;常規(guī)的化學試劑均為分析純。

1.3 引物探針 基因序列為，h β-actin forward:5'GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3';h β-actin probe:FAM-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGC-BHQ1;h β-actin reverse:5'CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3';h N-myc forward:5'CCA AGC CAG TTC CAT TAA AT3';h N-myc probe:FAMCAG GAG TCA GAT TCC AGG TTT ATG T-BHQ1;h N-myc reverse:5'GTC AGG AAT TTC AGT AAC ATT G3';h Fas forward:5'CAT CAT GAT GGC CAA TTC TGC C3';h Fas probe:FAM-CCT GTC CTC CAG GTG AAA GGA AAG C-BHQ1;h Fas reverse:5'TCT GGT TCA TCC CCA TTG ACT G3';h MTA1 forward:5'CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3';h MTA1 probe:FAM-CCA TCA AGG CCG AGT GCA CGG CGCBHQ1;h MTA1 reverse:5'TCA GCA CCA GCG GGC TCT G3';h nm23-H1 forward:5'TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3';h nm23-H1 probe:FAM-TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C-BHQ1;h nm23-H1 reverse:5'AAC GTA GTG TTC CTT GAG3。

1.4 人子宮內(nèi)膜(癌)組織總RNA的提取 (1)從超低溫冰箱中取出人子宮內(nèi)膜(癌)組織樣本，迅速剪下約0.25 g的樣品，置于預先加入200 μL RNAiso Plus的1.5 mL EP管中。(2)在 RNAiso Plus溶液中破碎人子宮內(nèi)膜(癌)組織，補充800 μL RNAiso Plus，混勻。在冰上靜置5min，再加入200 μL氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15 s(氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化后，在冰上靜置5min。(3)4℃，13 000 rpm高速離心樣品15 min后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置10 min，4℃ ，13 000 rpm離心10 min。(4)棄上清液，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，來回顛倒數(shù)次后，以4℃，13 000rpm離心5min。(5)棄上清液，空氣干燥RNA 10 min，用 20 μL DEPC 水溶解，立即取 2 μL RNA做反轉錄，剩余18 μL－80℃凍存。

1.5 逆轉錄反應 抽提的總RNA進行反轉錄，取2 μL RNA模板做逆轉錄反應。反應步驟為:(1)RNA 的熱變性，25 pmol/μL random primer 1 μL，RNase Free 水 9 μL，RNA 2 μL，總共12 μL，于 65℃水浴5 min后迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心收集反應液。(2)反應液配置，第一步變性后的RNA溶液 12 μL，5 × RT bμffer 4 μL，dNTP mixtμre(各 10 mmol)2μL，RNase Inhibitor(10 U/μL)1 μL，Rever Tra Ace 1μL。(3)反應程序為30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.6 熒光定量PCR反應 配制反應體系共25 μL:10 PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol dNTP 2 μL，dH2O 16 μL，15 pmol/μL 引物(1+1) μL，15 pmol/μL 探針 0.3 μL，5U/μL Taq 0.2 μL，Template 2μL。PCR buffer成分:100 mM Tris-HCl(pH 值 8.3)，500 mM KCl，15 mM MgCl2。反應過程:94℃ 2 min，94℃ 5 s，55℃ 30 s，共40個循環(huán)。讀取FAM熒光數(shù)值，30℃5s。樣本同一個檢測指標基因統(tǒng)一上機，每個標本分別做4個待檢測基因以及內(nèi)參β-actin的熒光定量PCR。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，基因表達量采取隨機獨立樣本的方差分析及兩兩對比的LSD-t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 N-myc基因在各組標本中表達量的比較 由表1可知，原癌基因N-myc在子宮內(nèi)膜癌未轉移組中表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=31.478，t= －6.049，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=44.770，t=－5.638，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯高于未轉移組(F=40.643，t= －5.309，P=0.000)。

表1 N-myc基因在三組標本中表達量的比較

2.2 Fas基因在各組標本中表達量的比較 由表2可知，抑癌基因Fas在子宮內(nèi)膜癌未轉移組中表達量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=18.948，t=5.622，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=20.760，t=6.024，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯低于未轉移組(F=11.335，t=4.979，P=0.001)。

表2 Fas基因在各組標本中表達量的比較

2.3 MTA1基因在各組標本中表達量的比較 由表3可知，腫瘤轉移促進基因MTA1在子宮內(nèi)膜癌未轉移組中表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=38.203，t= －10.132，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(F=42.035，t= －5.881，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯高于未轉移組(F=39.004，t=－5.488，P=0.000)。

表3 MTA1基因在各組標本中表達量的比較

2.4 nm23-H1基因在各組標本中表達量的比較

由表4可知，腫瘤轉移抑制基因nm23-H1在子宮內(nèi)膜癌未轉移組中表達量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=16.644，t=6.181，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(F=18.431，t=6.815，P=0.000);在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯低于未轉移組(F=45.018，t=12.232，P=0.000)。

表4 nm23-H1基因在各組標本中表達量的比較

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見婦科惡性腫瘤之一，是女性患者的主要死因之一。近年來子宮內(nèi)膜癌的防治已取得較大的進展，使子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率明顯下降，但有關子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及轉移的基因機制還未明確。因此，尋找子宮內(nèi)膜癌早期診斷的基因指標及有效治療子宮內(nèi)膜癌的方法，進一步明確子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學以及基因表達機制成為當前研究熱點。

凋亡是細胞區(qū)別于壞死的、主動的、程序化的細胞死亡，是一系列凋亡促進基因與抑制基因表達及相互作用造成細胞生存和死亡之間的選擇。N-myc基因作為一功能甚多的細胞凋亡抑制基因，通過表達產(chǎn)物發(fā)揮多種生物學效應。其在正常細胞中表達極低甚至不表達［5］。Fas是一種分子質(zhì)量為48ku的I型跨膜蛋白，屬于 TNF超家族。Fas配體(FasL)是一種分子質(zhì)量為40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白，也屬于TNF超家族。Fas與FasL結合相互作用是引起細胞凋亡的主要途徑之一。腫瘤浸潤淋巴細胞后激活淋巴細胞表達FasL，兩者特異性結合導致靶細胞內(nèi)源性自殺程序激活，細胞凋亡［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因N-myc在子宮內(nèi)膜癌組織轉移組與未轉移組中的表達量均高于正常子宮內(nèi)膜組織，且該基因在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯高于未轉移組，由此說明，N-myc基因與子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖及轉移呈正相關，即該基因促進子宮內(nèi)膜癌的形成，對轉移亦有促進作用，但具體的作用機制有待進一步研究。抑癌基因Fas在子宮內(nèi)膜癌組織轉移組及未轉移組中表達量均低于正常子宮內(nèi)膜組織，且該基因在子宮內(nèi)膜癌轉移組中表達量明顯低于未轉移組，由此說明，F(xiàn)as基因表達量降低與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關，與子宮內(nèi)膜癌的轉移亦相關。

腫瘤轉移是指惡性腫瘤細胞脫離原發(fā)腫瘤，通過各種轉移方式，到達繼發(fā)組織或器官后得以繼續(xù)增殖生長，形成與原發(fā)腫瘤性質(zhì)相同的繼發(fā)腫瘤的全過程。隨著分子生物學技術的進步，提出了腫瘤轉移機制的全新理論，即基因調(diào)控下多元體系。腫瘤的轉移是癌基因與抑癌基因參與凋節(jié)的復雜過程，通過腫瘤轉移相關基因的過度表達，以及一系列基因產(chǎn)物的參與，對腫瘤轉移全過程進行調(diào)控。nm23基因是從K-1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交法分離出來的一種與惡性腫瘤轉移有關的基因，即腫瘤轉移抑制基因。人類nm23基因有兩個亞型即nm23-H1、nm23-H2。發(fā)生淋巴轉移的惡性腫瘤與未發(fā)生淋巴轉移者相比，nm23-H1的表達水平明顯降低，未發(fā)生淋巴轉移的惡性腫瘤的nm23-H1表達陽性率明顯高于發(fā)生淋巴轉移者［7］。MTA1基因是從大鼠乳腺癌細胞系13762NF細胞中分離發(fā)現(xiàn)的，MTA1基因以共價修飾組蛋白、編碼轉錄因子、參與信號傳導途徑、調(diào)節(jié)有關基因的表達等方式，調(diào)節(jié)細胞的生長，影響腫瘤細胞的轉移。在MTA1過度表達的腫瘤一般均表現(xiàn)為深的漿膜層腫瘤浸潤度、高的淋巴結腫瘤轉移率和顯著的血管腫瘤侵襲性［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉移促進基因MTA1在子宮內(nèi)膜癌組織轉移組中的表達量明顯高于未轉移組，且該基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達量明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，由此說明，MTA1基因的過表達與子宮內(nèi)膜癌細胞轉移相關，并與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關。腫瘤轉移抑制基因nm23-H1在子宮內(nèi)膜癌組織轉移組及未轉移組中呈升表達，同時在子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組相比較中，該基因亦呈升表達趨勢，由此說明子宮內(nèi)膜癌的細胞轉移及增殖與nm23-H1基因表達均成負相關。

總之，通過本實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關基因體系可作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷與監(jiān)測的基因指標，亦可作為子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展及臨床治療的監(jiān)測指標，但其具體作用機制及臨床應用價值有待進一步研究。

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