唐海深 綜述 李東至 校審

（廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市婦女兒童醫(yī)療中心 產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623）

地中海貧血（thalassemia，地貧）又稱珠蛋白生成障礙性貧血，是由于珠蛋白合成不足所引起的遺傳性溶血性貧血，是人類最常見的單基因遺傳病，保守估計(jì)全世界有近2億地貧基因攜帶者，此病具有臨床上的嚴(yán)重性及世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率，嚴(yán)重危害人類健康。根據(jù)缺如或合成減少的珠蛋白鏈的種類，地中海貧血分為α、β、γ、δ等幾種亞類，其中α－地中海貧血最常見，β－地中海貧血次之。α－地貧主要見于東南亞和地中海地區(qū)，在我國(guó)則主要集中在南方地區(qū)，以廣西、廣東、海南和香港最多見，攜帶率為5．4%～17．55%不等，其中廣東省的α－地貧基因攜帶率為8．53%［1］。α－地貧臨床表現(xiàn)與α－珠蛋白鏈的合成減少的程度相關(guān)，靜止型和輕型α－地貧攜帶者自身可無(wú)臨床癥狀，但按照孟德爾遺傳規(guī)律，可能孕育重型地貧的胎兒，因此在α－地貧高發(fā)區(qū)進(jìn)行篩查尤為必要。隨著人們的不斷總結(jié)，新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)及聯(lián)合應(yīng)用，α－地貧的篩查向敏感度和特異度更高的方向發(fā)展，本文就α－地中海貧的血分子病理學(xué)基礎(chǔ)、遺傳學(xué)特點(diǎn)及其篩查方法做一綜述。

1 α－地中海貧血的分子病理學(xué)基礎(chǔ)

α－珠蛋白基因位于16號(hào)染色體上（16p13），每條染色體上有2個(gè)連鎖的α－珠蛋白基因（α1和α2），共4個(gè)，正常人以αα／αα表示。α－地中海貧血（α－thalassemia，α－地貧）是由于α－珠蛋白基因缺失或突變，使α－珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血，是人類最常見且危害最大的單因遺傳病之一。α－地貧根據(jù)單倍型染色體是否能合成α－珠蛋白鏈分為α－地貧－2（α＋－地貧）和α－地貧－1（α0－地貧），根據(jù)限制性內(nèi)切酶圖譜法是否能檢出明顯的基因缺失分缺失型α－地貧和非缺失型α－地貧。我國(guó)最常見的缺失型α－地貧－1為－SEA，缺失型α－地貧－2為－α3．7和－α4．2，非缺失型α－地貧以Hb CS與Hb QS最為多見。

2 α－地中海貧血的遺傳學(xué)特點(diǎn)

α－地貧在臨床上分為4種類型：靜止型、標(biāo)準(zhǔn)型、Hb H病和 Hb Bart’s胎兒水腫綜合征，其分子機(jī)制分別為有1、2、3、4個(gè)α－基因缺陷（缺失或突變）。靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型者可無(wú)臨床癥狀或僅輕微的血液學(xué)改變；Hb H病有輕至中度貧血，肝脾腫大，黃疸等；Hb Bart’s水腫胎常于妊娠晚期（23～38周）死亡或早產(chǎn)后數(shù)小時(shí)死亡。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型α－地貧純合子患兒貧血嚴(yán)重，甚至需要輸血治療。若夫婦雙方均為－SEA基因攜帶者，則胎兒有四分之一機(jī)會(huì)Hb Bart’s水腫胎；若夫婦一方為－SEA基因攜帶者，另一方為非缺失型α－地貧攜帶者，則有四分之一機(jī)會(huì)出生非缺失型Hb H病患兒。因此在α－地貧高危地區(qū)篩查－SEA基因和非缺失型α－地貧基因攜帶者尤為必要，是識(shí)別高危人群、預(yù)防重型地貧患兒出生的重要手段。

3 篩查方法

地貧的檢驗(yàn)方法很多，目前，國(guó)內(nèi)外用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)α－地貧基因的方法進(jìn)行地貧的診斷是目前診斷地貧的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于其方法復(fù)雜、設(shè)備技術(shù)要求高及費(fèi)用昂貴等原因，不能作為常規(guī)、大規(guī)模的檢查手段。大多數(shù)地貧基因攜帶者都不會(huì)知道自己帶有這種遺傳基因，因此只有通過對(duì)新生兒、婚前檢查、婚檢及產(chǎn)檢人群進(jìn)行地貧篩查，才能防止重型地貧兒的出生。

3．1 血液學(xué)常規(guī)檢測(cè) 地中海貧血的重要特征之一是小細(xì)胞低色素性貧血，通過涂片、瑞氏染色可觀察紅細(xì)胞形態(tài)，由于貧血輕重不一，紅細(xì)胞大小不均，可出現(xiàn)異型、嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率增高，貧血越重，異形性越明顯。地中海貧血最重要的血液學(xué)指標(biāo)為紅細(xì)胞平均體積（MCV），紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH），血紅蛋白（Hb），此外還有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞壓積。正常成人的 MCV、MCH的正常值分別為為82～95fl、27～31pg。一般來(lái)說(shuō)以 MCV≤82 fl，MCH≤27．0 pg作為地中海貧血的可疑指標(biāo)。有研究顯示：以MCV≤80 fl為界，篩查α－地貧－1（主要為－SEA／αα）的敏感性為92．9%，特異性為83．9%［2］。以MCH＜26．5 pg為界，篩查α－地貧－1的敏感性為95．2%，特異 性為 82．3%［3］。鄒漢良等［4］的研究顯：以紅細(xì)胞計(jì)數(shù)／平均紅細(xì)胞體積比值5．9作為篩查指標(biāo)其靈敏度為95．1% ，特異度為92．0%。值得注意的是，在機(jī)體缺乏鐵、鋅、銅、維生素B6以及鉛中毒等情況下，也可出現(xiàn)外周血紅細(xì)胞MCV和MCH降低，應(yīng)注意鑒別，臨床常有對(duì)這類患者以鐵劑治療，但往往達(dá)不到預(yù)期的療效。

3．2 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn) 其原理是地中海貧血攜帶者的紅細(xì)胞膜表面粗糙、凹陷、折疊和漿膜擴(kuò)展，膜與內(nèi)容物之比增大，對(duì)滲透溶解的抗性增加，在0．32% （或0．36% ）NaCl中溶解度降低 （脆性降低），一管法是地中海貧血群體篩查的一種簡(jiǎn)便方法。Supatra S等［5］的研究顯示，利用紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)篩查α－地貧－1的敏感性和特異性分別為95．0%和86%。紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)是地中海貧血群體篩查的一種簡(jiǎn)便方法，Hb Bart’s胎兒水腫綜合征和Hb H病患者明顯降低，標(biāo)準(zhǔn)型α－地貧也可降低，但是靜止型α－地貧一般正常。

3．3 血紅蛋白分析 血紅蛋白（Hb）是人體最主要的蛋白質(zhì)，承擔(dān)紅細(xì)胞運(yùn)輸O2和CO2的功能。人在不同發(fā)育時(shí)期血紅蛋白組成不同，胚胎期主要血紅蛋白為：Hb Gower 1（§2?2）、Hb Gower 2（α2?2）、Hb Portland（§2γ2）；胎兒期及新生兒期主要為Hb F（α2γ2），還有少量 Hb A（α2β2）和微量 Hb A2（α2δ2）；成 人 期 血 紅 蛋 白 組 成 為：Hb A（α2β2）：96．5%～97．5%，Hb A2（α2δ2）：2．5%～3．5%，HbF（α2γ2）：0～1．0%。α－地貧是由于α－基因缺陷使α－鏈合成減少，因此新生兒α－地貧會(huì)由于α－鏈減少而導(dǎo)致γ鏈相對(duì)增多，形成 Hb Bart’s（γ4）。由于各種血紅蛋白均帶電荷，且等電點(diǎn)在7以下，因此在堿性緩沖液中均帶負(fù)電荷，由于不同的血紅蛋白等電點(diǎn)不同，故在電場(chǎng)的作用下因向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)的速度不一而分離。被稱為“電泳之父 ”的瑞典學(xué)者Tiselius在1937年創(chuàng)建了電泳技術(shù)，隨后Hb電泳技術(shù)因支持物的不同經(jīng)歷了濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳等。利用Hb A2篩查α－地貧的敏感性和特異性均不高，且與基因診斷的結(jié)果可能不符［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道，HPLC檢測(cè)β地貧與經(jīng)基因確診的符合率可達(dá)97．6%，而α地貧的符合率為 62．6%［7］。因此血紅蛋白分析單獨(dú)檢測(cè)成人α－地貧的特異性和敏感性均不高，血紅蛋白電泳技術(shù)檢測(cè)α－地貧適用于新生兒期，成人則應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用其它篩查方法。1958年Ager等已發(fā)現(xiàn)臍血中存在Hb Bart’s，此后此成分與α－珠蛋白基因缺陷間有何關(guān)系引起了國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的關(guān)注。分離定量Hb Bart’s的技術(shù)有醋酸纖維膜電泳、等電聚焦（IEF）、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）等。其中毛細(xì)管電泳分辨率高、定量準(zhǔn)確、所需樣品少，具有快速、高效、敏感、自動(dòng)化優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)異常血紅蛋白、分離定量血紅蛋白各組分［8］。與HPLC相比，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)分離、定量Hb H和Hb Bart’s更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確［9］。

隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，分離定量Hb Bart’s邁向了準(zhǔn)確、高效、自動(dòng)化的方向。Munkongdee T等［8］對(duì)587例泰國(guó)新生兒臍血進(jìn)行毛細(xì)管電泳電泳Hb Bart’s定量篩查α－地貧，研究顯示：缺失1、2、3個(gè)α－基因的α－地貧攜帶者，其臍血Hb Bart’s含量分別為（0．5±0．2）%、（4．6±0．5）%、20．1；該研究還顯示，正常人與α＋－地貧攜帶者之間的Hb Bart’s含量相互重疊，不能區(qū)分。以 Hb Bart’s含量0．2%為界，區(qū)分正常人與α＋－地貧攜帶者的效率最高。何曉玲等［10］，亦用毛細(xì)管電泳電泳技術(shù)定量Hb Bart’s的方法篩查中山市新生兒的α－地貧，研究結(jié)果中Hb Bart’s的含量與基因缺陷個(gè)數(shù)的關(guān)系與 Munkongdee T的研究相符，但Hb Bart’s水平不宜作為診斷靜止型α－地貧的篩查指標(biāo)?？梢?，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)分辨率高、定量準(zhǔn)確、所需樣品少，具有快速、高效、敏感、自動(dòng)化優(yōu)點(diǎn)；但是，血紅蛋白電泳技術(shù)檢測(cè)α－地貧適用于新生兒期，檢測(cè)成人α－地貧的特異性和敏感性均不高。

3．4 聯(lián)合篩查 許多研究表明，聯(lián)合檢測(cè)可以大大提高地貧篩查的特異度，但比單項(xiàng)檢測(cè)的靈敏度降低。MCV（＜80 f L）、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)（溶血百分率小于60%）、Hb電泳分析（Hb A2＜2．5%）等3種方法單項(xiàng)檢測(cè)對(duì)α－地貧診斷的靈敏度分別為91．0%、81．9%和69．8%，MCV、紅細(xì)胞脆性和Hb電泳3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的特異度達(dá)100．0%［11］。此外，聯(lián)合檢測(cè)與單項(xiàng)檢測(cè)相比，對(duì)輕型地貧具有較好的篩查作用。

4 常見非缺失型α－地貧的篩查

由于Hb Bart’s水腫胎的致死性，臨床上出生后最嚴(yán)重的α－地中海貧血類型是Hb H病。Hb H病有兩種常見類型：缺失型Hb H病和非缺失型Hb H病，缺失型Hb H病較多見，但非缺失型Hb H病，尤其是那些產(chǎn)生極不穩(wěn)定的α－珠蛋白變異體的非缺失型Hb H病臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重：患者貧血癥狀更嚴(yán)重、易出現(xiàn)肝脾腫大、需要輸血的次數(shù)增加［12］。在α0－地貧攜帶率高的地區(qū)（α0－地貧（－SEA）攜帶率在亞洲不同地區(qū)為3%～14%不等，其中泰國(guó)北部為4．6%、香港4．1%、廣東省4．1%［1］，當(dāng)夫妻一方為－／αα?xí)r，就應(yīng)排除另一方為非缺失型α＋－地貧攜帶者。此外，還有非缺失型純合子（αCSα純合子與αQSα純合子）引起水腫胎的報(bào)道［13］。目前，已報(bào)道近70種非缺失型α－地貧，非缺失型基因改變從mRNA轉(zhuǎn)錄、剪接到蛋白質(zhì)的翻譯和修飾不同階段影響珠蛋白連的延伸或剪接，從而影響珠蛋白基因的表達(dá)。因此，非缺失型α＋－地貧攜帶者的篩查對(duì)指導(dǎo)優(yōu)生和預(yù)防重型Hb H病患兒及重型非缺失型純合子患兒的出生具有重要臨床意義。我國(guó)常見的非缺失型α－地貧為Hb CS與Hb QS。

4．1 Hb CS篩查 Hb Constant Spring（CS）是我國(guó)最常見的非缺失型α－地貧基因類型，廣東省的發(fā)病率為0．3%［14］。Hb CS的產(chǎn)生是由于α2基因第三外顯子CD142（TAA＞CAA）［Term→Gln］的終止密碼子突變，使合成的α－珠蛋白鏈異常延長(zhǎng)，具有172個(gè)氨基酸殘基，其m RNA極不穩(wěn)定，導(dǎo)致α2－珠蛋白鏈合成減少。αCS－珠蛋白與α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白（αhemoglobin－stabilizing protein，AHSP）受損結(jié)合形成Hb CS，在αCSα雜合子中Hb CS約占整個(gè)血紅蛋白的1%～2%。目前研究顯示可通過毛細(xì)管血紅蛋白電泳技術(shù)和高效液相色譜法篩查Hb CS，但毛細(xì)管電泳技術(shù)更為優(yōu)越。Can Liao等［14，15］的研究顯示：毛細(xì)管電泳對(duì)Hb CS定量可低至0．1%；99%的αCSα雜合子 Hb CS含量為0．1%～1．0%，均值為0．6±0．1%，而 Hb H－CS的 Hb CS水平高達(dá)2．2%；并且毛細(xì)管電泳技術(shù)篩查Hb CS的敏感性為100%，而高效液相色譜法篩查Hb CS的敏感性只有76%。S．Pornprasert等［24］的研究也證實(shí)毛細(xì)管泳技術(shù)是篩查Hb CS一種非?？煽康氖侄?，Hb CS%的水平在αCSα純合子與Hb HCS間沒有明顯區(qū)別（2．8±1．3），但均明顯高于αCSα雜合子（0．4±0．2）。還有為比較毛細(xì)管泳技術(shù)和高效液相色譜法篩查Hb CS的研究顯示，用兩種不同的方法測(cè)量比較，毛細(xì)管泳技術(shù)測(cè)得Hb CS的水平更高：αCSα雜合子的 Hb CS（%）分別為0．4±0．2（0．1～0．8）和 0．1±0．3（0．0～1．2），Hb H－CS的Hb CS（%）分別為1．7±1．7（0．2～4．6）和0．6±1．0（0．0～3．7），αCSα純合子的 Hb CS（%）分別為3．0±1．0（2．0～5．0）和1．0±0．7（0．0～2．7）［16］。

4．2 Hb QS及其他非缺失型α－地貧的篩查 Hb Quong Sze（QS）是由于α2基因第三外顯子CD125（CTG＞CCG）［Leu→Pro］的點(diǎn)突變，其發(fā)病率在我國(guó)非缺失型α－地貧中，僅次于Hb CS。與Hb CS相比，Hb QS極不穩(wěn)定，高效液相色譜法和毛細(xì)管血紅蛋白電泳技術(shù)均不能篩查Hb QS。近年來(lái)興起的一種遺傳學(xué)分析方法——高分辨率熔解曲線（high－resolution melting，HRM）技術(shù)，能有效地篩查非缺失型α－地貧，引起了越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。由于核酸分子的物理性質(zhì)不同，不同核酸分子的片段長(zhǎng)短、GC含量及分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時(shí)都會(huì)有自己熔解曲線的形狀和位置，HRM技術(shù)的基本原理就是借助飽和熒光染料監(jiān)測(cè)核酸分子的熔解情況，根據(jù)熔解曲線的不同來(lái)對(duì)樣品來(lái)進(jìn)行區(qū)分，可對(duì)擴(kuò)增片段未知突變進(jìn)行掃描，也能對(duì)已知、特定突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

Shih HC等［17］應(yīng)用 HRM 結(jié)合nested PCR，先分別擴(kuò)增α2－和α1－珠蛋白基因，再分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增3個(gè)外顯子用于HRM分析，成功檢測(cè)異常血紅蛋白，包括Hb QS和Hb CS，此方法過程較為復(fù)雜。Liu YN等［18］單獨(dú)針對(duì)HRM技術(shù)快速有效的篩查Hb QS做了一項(xiàng)研究，結(jié)果為HRM技術(shù)成功將αQSα基因攜帶者全部檢出，曲線集成3簇：正常對(duì)照（αα／αα）集成一簇，Hb QS雜合子（αQSα／αα）集成一簇，Hb H－QS（αQSα／－SEA）和 Hb QS－α4．2（αQSα／－α4．2）集成一簇，HRM 檢測(cè) Hb QS的敏感性和特異性均為100%。此方法簡(jiǎn)便、快速，且避免了只擴(kuò)增α2－珠蛋白基因而導(dǎo)致Hb H－QS和Hb QS純合突變可能會(huì)因?yàn)槿劢鉁囟扰c野生型相差不大而難以區(qū)分的假陰性。隨后，Liu YN等［19］又在 HRM 技術(shù)篩查Hb QS的基礎(chǔ)上增寬了范圍，用HRM技術(shù)分別篩查α－珠蛋白基因的3個(gè)外顯子，結(jié)果為HRM技術(shù)成功將非缺失型α－地貧攜帶者與異常血紅蛋白全部檢出，敏感性和特異性亦均為100%。HRM技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、高通量、低成本、閉管操作等優(yōu)點(diǎn)，但是，HRM技術(shù)對(duì)PCR反應(yīng)、熔解儀器、熒光染料要求較高，突變掃描也不能精確區(qū)分?jǐn)U增片段中不同雜合突變所致的曲線差異。

5 意 義

α－地貧篩查是確診與控制α－地貧的基石，通過篩查可以有效地控制重型地貧兒的出生，同時(shí)節(jié)省醫(yī)療資源。此外，臨床上的基因診斷一般是聯(lián)合應(yīng)用gap－PCR技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)分別檢測(cè)3種常見的缺失型α－地貧基因型（－SEA、－α3．7、－α4．2）和3種常見非缺失α－地貧基因型（αCSα、αQSα、αWSα），這兩種方法只能能檢測(cè)出98%左右的α－地貧，還可能漏診罕見的α－珠蛋白基因簇的大片段缺失或罕見的點(diǎn)突變，而攜帶大片段缺失（α0－地貧）的患者一般會(huì)有臨床表現(xiàn)，且篩查為陽(yáng)性。因此在日常臨床工作中，α－地貧的診斷應(yīng)按照血液學(xué)常規(guī)檢測(cè)—血紅蛋白電泳分析—基因分型的順序，不能跳過篩查直接基因診斷，以免漏診。

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