王程棟，王樹聲*，胡慶輝，趙洪東，王春生，邵理祥

（1.農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，濟(jì)南250100；3.山東日照煙草有限公司，山東 日照 276826）

光合作用提供植物生命活動(dòng)所需的基礎(chǔ)能量，是植物獲得能量的主要來源，但光合器官對(duì)外界脅迫反應(yīng)比較敏感，尤其是鹽脅迫會(huì)直接影響光合機(jī)構(gòu)的結(jié)構(gòu)與活性，使植物光合作用下降[1]。

植物葉片結(jié)構(gòu)與其抗逆性密切相關(guān)，細(xì)胞也具有與之相適應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)[2-3]，逆境脅迫促使葉片細(xì)胞改變細(xì)胞器結(jié)構(gòu)以應(yīng)對(duì)不利條件，而目前研究鹽脅迫對(duì)葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響主要集中在采收籽粒為主的作物上，且多在籽粒成熟期研究生殖生長(zhǎng)對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響，而烤煙作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，以收獲葉片為主要耕作目標(biāo)，目前對(duì)于烤煙等采收葉片的作物研究較少，特別是在受鹽脅迫時(shí)烤煙葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化規(guī)律方面研究薄弱。本研究以烤煙品種NC89為材料，通過分析NaCl脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，從解剖學(xué)角度揭示鹽脅迫對(duì)烤煙細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，探討烤煙葉片超微結(jié)構(gòu)對(duì)鹽脅迫的反饋機(jī)制，為烤煙的耐鹽機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與鹽脅迫處理

試驗(yàn)于 2010年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨試驗(yàn)基地溫室內(nèi)進(jìn)行，供試烤煙品種為NC89，采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行砂培。打頂后，使用350 mmol/L的NaCl / Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行為期8 d的鹽脅迫處理，Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照，每次澆灌250 mL，3次重復(fù)。

1.2 電鏡制樣及觀察測(cè)量

在鹽脅迫0、2、4、6、8 d后取中部煙葉作為觀察材料，在葉中部主脈附近切下2 mm×2 mm的葉片，4% Glutaraldehyde和1% Osmiumtetroxide分別進(jìn)行前、后固定，使用PBS進(jìn)行清洗并梯度酒精脫水，采用環(huán)氧丙烷置換，Epon 812包埋，超薄切片，采用醋酸鈾和檸檬酸鉛對(duì)染染色，Hitachi C-7000透射電鏡觀察拍照。

葉綠體基粒類囊體垛疊數(shù)觀測(cè)：在透射電鏡下每個(gè)處理選擇 10個(gè)有代表性的葉綠體，每個(gè)葉綠體選擇1個(gè)基粒，記錄所選基粒的類囊體垛疊數(shù)并測(cè)量長(zhǎng)度。

2 結(jié) 果

2.1 葉綠體形態(tài)變化

對(duì)照葉綠體沿細(xì)胞壁邊緣排列，長(zhǎng)軸與細(xì)胞壁平行，形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)濃厚，葉綠體片層成平行排列，結(jié)構(gòu)整齊，葉綠體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完整，基粒類囊體垛疊均大于15，生理活性強(qiáng)，含較多小淀粉粒（圖1①）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉綠體形態(tài)并未隨處理時(shí)間的增加而發(fā)生明顯改變，處理后2、4、6、8 d共4次取樣，其類囊體垛疊數(shù)呈現(xiàn)作物自然衰老時(shí)的緩慢變化規(guī)律[4]，幾個(gè)時(shí)期樣品垛疊數(shù)差異不顯著（圖2、3）。

NaCl處理2 d葉片細(xì)胞葉綠體片層結(jié)構(gòu)清晰，形狀略有改變，部分觀察到扭曲變形，但類囊體排列有序，通過對(duì)基粒垛疊數(shù)及類囊體長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，兩者均未見明顯減小，葉綠體內(nèi)淀粉粒發(fā)育充盈，切片時(shí)出現(xiàn)切痕（圖1②）。

NaCl處理4 d葉片細(xì)胞葉綠體片層結(jié)構(gòu)松散，部分膜變得模糊，同時(shí)，基粒片層松散、變形，有斷裂的現(xiàn)象，可明顯觀察到片層之間的離散，垛疊之間出現(xiàn)明顯空隙，失去清晰的片層結(jié)構(gòu)（圖1③）。

NaCl處理6 d葉片細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)松散，進(jìn)一步腫脹、變形，失去完整結(jié)構(gòu)，不再具有與細(xì)胞質(zhì)之間的明顯界限，同時(shí)，嗜鋨顆粒增多，體積變大，基粒片層出現(xiàn)斷裂，扭曲、變細(xì)，可觀察到絲狀片層，整體結(jié)構(gòu)紊亂（圖1④），淀粉粒膨大。

圖1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化Fig.1 Change of chloroplasts ultra structure

圖2 350 mmol/L NaCl脅迫對(duì)基粒類囊體垛疊數(shù)的影響Fig.2 Effect of 350 mmol/L NaCl stress on thylakoid number in grana

圖3 350 mmol/L NaCl脅迫后基粒類囊體長(zhǎng)度變化Fig.3 Effect of 350 mmol/L NaCl stress on thylakoid length in grana

NaCl處理8 d后，部分葉片細(xì)胞葉綠體基本無法觀察到整齊的片層結(jié)構(gòu)，但其淀粉粒發(fā)育較好，與自然衰老的葉肉細(xì)胞相比，未見明顯的被膜破裂。

2.2 線粒體形態(tài)變化

對(duì)照葉肉細(xì)胞線粒體呈球形，形態(tài)飽滿，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，可觀察到內(nèi)膜凹陷形成的嵴，被膜完整，基質(zhì)豐富，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分線粒體仍保持較好狀態(tài)，結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化（圖4①）。

NaCl處理2 d線粒體結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜系統(tǒng)未見明顯破壞，外形近球形，形態(tài)飽滿，可明顯觀察到內(nèi)膜凹陷，與對(duì)照相比，部分膜模糊，但整體上差異不大（圖4②）。

NaCl處理4 d線粒體嵴沒有明顯的減少，外膜結(jié)構(gòu)完整，部分線粒體呈扁球形，此時(shí)與對(duì)照相比，內(nèi)膜系統(tǒng)可觀察到較多的嗜鋨顆粒，部分膜模糊，但線粒體的內(nèi)、外膜及嵴仍清晰可見（圖4③）。

NaCl處理6 d內(nèi)膜破壞更為嚴(yán)重，嵴的數(shù)量進(jìn)一步減少，且嗜鋨顆粒增加明顯，內(nèi)、外膜膨脹，與對(duì)照相比，部分線粒體無法清晰辨認(rèn)出內(nèi)、外膜間的界限，電鏡下觀察線粒體著色不均（圖4④）。

NaCl處理8 d后，線粒體結(jié)構(gòu)崩潰，大部分內(nèi)膜已經(jīng)破裂，無結(jié)構(gòu)清晰的嵴，內(nèi)部絕大部分為空泡，但大多數(shù)外膜保持完整，發(fā)現(xiàn)了少數(shù)外膜破裂的情況（圖4⑤，4⑥）。

圖4 線粒體超微結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Change of mitochondrial ultra structure

2.3 其他超微結(jié)構(gòu)變化

對(duì)照葉片細(xì)胞核液濃度較高（圖5①），隨脅迫時(shí)間的增加，核液濃度不斷降低，脅迫4 d時(shí)，核內(nèi)即出現(xiàn)明顯的異染色質(zhì)化，但仍可見清晰的核仁（圖5②）；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，異染色質(zhì)化程度逐漸加深，與對(duì)照相比差異顯著（圖5③）。

此時(shí)細(xì)胞內(nèi)多數(shù)細(xì)胞器已失去完整結(jié)構(gòu)，同時(shí)伴隨出現(xiàn)大量的電子密集的沉積物（圖5④），且出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離（圖5⑤），液泡所占細(xì)胞比例變小，細(xì)胞質(zhì)膜出現(xiàn)斷裂破損，細(xì)胞內(nèi)有大量的嗜鋨顆粒（圖5⑥）。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，光溫水等外界環(huán)境均會(huì)對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，而葉綠體對(duì)鹽分也極為敏感[5]。植物在受到鹽脅迫傷害時(shí)，葉綠體膜極易被破壞[6-7]。未進(jìn)行鹽脅迫處理時(shí)，葉綠體結(jié)構(gòu)較好，基粒片層清晰，類囊體完整，脅迫處理后葉綠體結(jié)構(gòu)松散、變形，基粒片層模糊，破壞嚴(yán)重的基粒片層扭曲，失去完整結(jié)構(gòu)[8-9]，此變化規(guī)律在大麥、小麥、水稻、甘薯[10-12]等作物上均被證實(shí)。本研究在烤煙上同樣觀察到葉綠體結(jié)構(gòu)隨著 NaCl脅迫時(shí)間的增加，變化越明顯，老化速度加快，片層逐漸解體，嗜鋨顆粒增大、增多，結(jié)構(gòu)趨向簡(jiǎn)單。由于脅迫后細(xì)胞膜兩側(cè)滲透壓發(fā)生改變，進(jìn)而影響到細(xì)胞正常的生理代謝，葉綠體功能紊亂，其排列位置也發(fā)生了變化。

線粒體是細(xì)胞能量的供給者，曾經(jīng)被認(rèn)為是對(duì)脅迫不敏感的細(xì)胞器[13-14]，但筆者觀察發(fā)現(xiàn)，烤煙細(xì)胞線粒體對(duì)鹽脅迫比較敏感，脅迫后線粒體外形首先改變，由較規(guī)則的球形變?yōu)榻鼨E圓形，同時(shí)內(nèi)膜系統(tǒng)開始降解，逐步喪失完整結(jié)構(gòu)。

植物在適應(yīng)外界環(huán)境改變時(shí)，其細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，比如細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間增加接觸面積，形成較為牢固的結(jié)合點(diǎn)和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，確保脅迫時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁結(jié)合緊密[15-16]，降低或減少質(zhì)壁分離的發(fā)生[17]，同時(shí)細(xì)胞核變大。在部分作物中還發(fā)現(xiàn)了質(zhì)膜向細(xì)胞內(nèi)方向凹陷，形成囊泡[18]，以降低鹽分對(duì)細(xì)胞正常生理活動(dòng)影響的現(xiàn)象。筆者發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫導(dǎo)致烤煙葉片細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，除上述葉綠體和線粒體外，細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定性、細(xì)胞核形態(tài)、液泡充盈程度、細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)也發(fā)生明顯變化，在此過程中，細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，而發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，最終大液泡體積變小，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜破損、模糊，穩(wěn)定性下降，這些結(jié)構(gòu)的改變說明烤煙在鹽脅迫條件下自身抵抗能力不強(qiáng)。

圖5 其他細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)變化Fig.5 Change of other organelle ultra structure

4 小 結(jié)

隨脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，烤煙葉肉細(xì)胞葉綠體受損嚴(yán)重，處理6 d后類囊體平均長(zhǎng)度降到0.2042 μm，與對(duì)照相比，脅迫后第6 d類囊體垛疊數(shù)即明顯降低，基質(zhì)濃度下降，嗜鋨顆粒增加。與自然衰老相比，鹽脅迫對(duì)烤煙細(xì)胞類囊體結(jié)構(gòu)變化影響較大，內(nèi)膜系統(tǒng)降解更為徹底，但外膜完整性保持較好，處理8 d后基粒完全降解時(shí)，葉綠體被膜未見明顯破裂。線粒體在鹽脅迫條件下結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，處理4 d后內(nèi)膜系統(tǒng)即明顯觀察到受損，外形變化明顯，嵴減少，處理8 d后內(nèi)膜完全降解，部分線粒體可觀察到外膜受損，與自然衰老相比，內(nèi)膜系統(tǒng)破壞較重。此外，烤煙葉片細(xì)胞核液濃度隨著脅迫時(shí)間的增加不斷降低，核內(nèi)異染色質(zhì)化明顯，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)異染色質(zhì)化與對(duì)照相比差異顯著，并同時(shí)伴隨出現(xiàn)大量的電子密集的沉積物。

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