李 理，楊新周，劉汗青,*

（1.昆明冶金高等?？茖W(xué)校環(huán)境工程學(xué)院，昆明 650033；2.云南煙草科學(xué)研究院，昆明 650106）

煙草中含有豐富的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分，這些物質(zhì)與煙草質(zhì)量密切相關(guān)，對(duì)煙氣的感官性質(zhì)有重要影響，因此被列為評(píng)價(jià)煙草質(zhì)量的重要參數(shù)[1]。以往的分析方法中，無(wú)論是水蒸氣蒸餾，還是同時(shí)蒸餾萃取都需要大量有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理[2]，且操作時(shí)間較長(zhǎng)、繁瑣，不能滿足快速準(zhǔn)確分析的要求。

固態(tài)萃取攪拌棒（SBSE）是近幾年新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)之一。1999年加拿大學(xué)者 Arthur和Janusz Pawliszyn等學(xué)者在研究固相微萃取（SPME）技術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然樣品中被測(cè)定物質(zhì)的濃度很高，但是SPME測(cè)定的回收率仍然很低，測(cè)定的靈敏度仍然不夠高[3]。他們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：將聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂敷在萃取棒上（膜厚0.5-1.0mm），萃取棒固相萃取體積是SPME的50倍以上[4]，具有比SPME更小的相比（水相體積/PDMS相體積），獲得了很高的測(cè)定靈敏度和回收率。之后，Gerstel GmbH公司實(shí)現(xiàn)了商品化的磁力攪動(dòng)吸附萃取棒。從此，SBSE應(yīng)用于各種水體樣品中痕量有機(jī)物的分離和濃縮。它不同于傳統(tǒng)的液液萃取、固液萃取等。SBSE不需要有機(jī)溶劑，是一種環(huán)境友好型、簡(jiǎn)便的萃取技術(shù)，特別是在許多易乳化、不均勻的樣品中表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢(shì)。

SBSE的解吸有熱解吸與溶劑解吸2種方式。應(yīng)根據(jù)分析對(duì)象的物理性質(zhì)來(lái)選擇合理的解吸方法。如果萃取的是熱不穩(wěn)定、不揮發(fā)物質(zhì)，則采用溶劑解析，再用HPLC分析[5]。

目前，該方法在國(guó)外已被廣泛應(yīng)用到食品[6-7]、環(huán)境[8-9]等領(lǐng)域，成為了一種簡(jiǎn)便、靈敏的分析技術(shù)，而在國(guó)內(nèi) SBSE的應(yīng)用還不夠廣泛。本研究采用SBSE萃取煙草揮發(fā)性與半揮發(fā)性成分，萃取后的攪拌棒放入熱解吸－冷進(jìn)樣系統(tǒng)（TD-CIS）實(shí)現(xiàn)解吸并導(dǎo)入氣相色譜/質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)還對(duì)影響SBSE和Thermal desorption system (TDS）的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑、材料

Gerstel Twister攪拌棒（長(zhǎng)20 mm，厚0.5 mm），Gerstel TDU-3熱解吸裝置，Gerstel玻璃熱脫附管（4 mm i.d.×178 mm），Gerstel CIS冷進(jìn)樣系統(tǒng)（德國(guó)Gerstel公司）；Clarus 500 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Pekin-Elmer 公司）；HP-5MS毛細(xì)管柱（0.25 mm i.d.×30 mm×0.25 μm，美國(guó)）；恒溫加熱磁力攪拌器（杭州儀表廠JB-007）；AEU-210電子天平（感量 0.0001g，日本島津公司）；B8510E 超聲波振蕩器（上海必能信超聲有限公司）。

自制蒸餾水；乙醇（分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠）；Na2SO4（分析純，天津試劑一廠）；云南烤煙B3F。

1.2 儀器條件

SBSE萃取條件：萃取溫度為室溫（30 ℃），萃取時(shí)間1 h，攪拌速度為1 000 r/min。

熱解吸條件：從20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持 4 min，不分流進(jìn)樣，傳輸線溫度350 ℃。

冷進(jìn)樣系統(tǒng)條件：采用溶劑排空模式進(jìn)樣，分流比30:1，冷聚焦溫度為-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，保持5 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：色譜柱溫 40 ℃保持 2 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，流速1.2 mL/min；GC/MS傳輸線溫度為280 ℃；電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為 230 ℃，電子能量為70 eV；采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍為30～400 m/z，用NIST02和WILEY7n標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。

1.3 操作步驟

攪拌棒在使用前夜放入TDS熱脫附管中老化。將煙葉樣品粉碎后過(guò)100目篩，稱取10 g樣品于100 mL錐形瓶中，加入30 mL乙醇，超聲萃取30 min后，取上層萃取液2 mL加入到25 mL頂空瓶中，加入18 mL蒸餾水后放入攪拌棒，并密封好玻璃瓶。放入老化好的攪拌棒，在室溫下，以 1000 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌60 min。萃取完成后使用干凈的鑷子將攪拌棒從樣品瓶中取出，用蒸餾水沖洗攪拌棒上的附加物質(zhì)（如糖、蛋白質(zhì)及其它臟物）后，放在干燥的棉布上擦干凈，再將干凈的攪拌棒放入玻璃脫附管中部，以便使其均勻加熱，進(jìn)而達(dá)到樣品完全解吸。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 攪拌液中乙醇含量 采用超聲法用乙醇對(duì)煙草樣品萃取，然后用蒸餾水稀釋乙醇萃取液再進(jìn)行攪拌棒吸附萃取。實(shí)驗(yàn)中考察了攪拌液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)（5%、8%、10%、15%、20%）對(duì)攪拌棒萃取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出，當(dāng)攪拌液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)小于10%時(shí)，隨著乙醇含量的升高，攪拌棒萃取效率（以峰面積計(jì)）增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，萃取量最大，之后乙醇含量再升高反而降低萃取效率。因此，本實(shí)驗(yàn)確定攪拌液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on extraction efficiency

2.1.2 萃取時(shí)間 萃取時(shí)間是影響樣品中各組分從水溶液轉(zhuǎn)移進(jìn)入攪拌棒的一個(gè)重要因素，達(dá)到平衡后再無(wú)限地延長(zhǎng)萃取時(shí)間也沒(méi)有實(shí)際意義。在室溫條件下，分別稱量相同的樣品，將攪拌速度控制在1000 r/min，萃取時(shí)間選取25、35、45、60、70、80 min，獲得不同時(shí)間條件下色譜峰面積總和，來(lái)確定最佳萃取時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖 2。可以看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，在25～45 min內(nèi)色譜峰峰面積總和迅速增加，60 min后，峰面積增加減緩，最后趨于平穩(wěn)。考慮到實(shí)驗(yàn)周期和工作效率，將萃取時(shí)間定為60 min。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.3 攪拌液離子強(qiáng)度 SPE是SPME和SBSE的理論基礎(chǔ)，因此，離子強(qiáng)度對(duì)SBSE的萃取也會(huì)產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)中分別向樣品中加入不同質(zhì)量濃度的Na2SO4水溶液（0%、4%、7%、10%），調(diào)節(jié)樣品離子強(qiáng)度，使待測(cè)物溶解度降低。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度增加，月桂酸、葵酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等的峰面積增加，但二氫獼猴桃內(nèi)酯、鄰苯二甲酸酯、棕櫚酸乙酯、吲哚-2-甲酸乙酯等的峰面積變小。加入Na2SO4水溶液與未加Na2SO4相比較，并未檢測(cè)到更多的物質(zhì)。可見(jiàn) Na2SO4的加入并不能明顯提高該樣品的萃取效率，同時(shí)隨 Na2SO4濃度的增加，多數(shù)物質(zhì)萃取效率反而降低。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇不加入Na2SO4。

綜合上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定SBSE萃取條件為：攪拌液乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，不加Na2SO4，以1000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌吸附60 min。

2.2 TDS技術(shù)條件的優(yōu)化

萃取棒上所吸附的樣品能否實(shí)現(xiàn)完全解吸，關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在相同的SBSE條件下，熱解吸溫度（A）、解吸時(shí)間（B）和進(jìn)樣口冷聚焦溫度（C）3個(gè)實(shí)驗(yàn)條件是影響被分析物從攪拌棒上轉(zhuǎn)移至氣相色譜的主要參數(shù)。因此，固定SBSE條件，應(yīng)用正交試驗(yàn)法，在3個(gè)水平上對(duì)3個(gè)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，制定出正交試驗(yàn)表（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素－水平表Table1 Factor and level of orthogonal test

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小依次為：進(jìn)樣口冷聚焦溫度＞熱解吸溫度＞解吸時(shí)間，即冷肼溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大。較好的實(shí)驗(yàn)水平組合為A1B2C3，即SBSE在250 ℃下脫附4 min，以-30 ℃的溫度冷肼捕集，得到的被測(cè)物質(zhì)的總峰面積最大。

2.3 樣品分析

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)該煙草樣品進(jìn)行測(cè)定，得到樣品總離子流色譜圖（圖3），共分離得到 63個(gè)組分，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索色譜峰分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2中采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分百分含量（各組分峰面積/總峰面積）。定性分析是將未知物的圖譜與NIST02和WILEY7n標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)相比較，選取匹配度大于85%（最大值為100%）的作為鑒定結(jié)果，共鑒定出32個(gè)組分，占總峰面積的97%。從表中可以看出，樣品含有大量的酯類和烯類、酸類化合物，其中酯類占28%、烯類占 19%、酸類占 16%，同時(shí)還含有少量醇類（9%）和醛類（6%）等化合物，這些化合物都是特征香氣的物質(zhì)，能反映該煙草的品質(zhì)特點(diǎn)。與彭夫敏[10]，胡群[11]報(bào)道的煙草揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果相對(duì)照，主要物質(zhì)組成基本一致。

圖3 樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of a real sample

表2 樣品主要化學(xué)成分及其相對(duì)含量Table 2 The major components of real sample and their relative contents

2.4 實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性

分別稱量同一樣品相同質(zhì)量6份，同一天內(nèi)在上述確定的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，32個(gè)組分的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）最大的是維甲酸甲酯，為12.3%；最小的是3-羥基-4-甲基苯甲醛，為3%。其中有29個(gè)組分的RSD小于10%，平均值為7.5%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié) 論

本研究采用攪拌棒萃取和熱脫附作為前處理技術(shù)，結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜測(cè)定了煙草揮發(fā)性與半揮發(fā)性成分，從樣品中鑒定出 32個(gè)不同化學(xué)成分，這些物質(zhì)能反應(yīng)該樣品的香氣特征。并對(duì)影響攪拌棒與熱解吸的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了考察與優(yōu)化，得到的較優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件是：攪拌棒萃取條件為室溫（30 ℃）下，不加入Na2SO4，以1000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌吸附60 min；熱解吸實(shí)驗(yàn)條件為從20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持4 min，被測(cè)組分通過(guò)流速為50 mL/min的氦氣轉(zhuǎn)移到冷進(jìn)樣系統(tǒng)中進(jìn)行冷肼聚焦；冷進(jìn)樣系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)條件為采用溶劑排空模式進(jìn)樣，分流比30:1，冷聚焦溫度為-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，將萃取的目標(biāo)分析物轉(zhuǎn)移至氣相色譜/質(zhì)譜中進(jìn)行分離和鑒定。同一樣品6次測(cè)定的不同組分峰面積的RSD平均值小于10%，說(shuō)明建立的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好，與傳統(tǒng)的分析方法相比，分析時(shí)間縮短為原來(lái)的三分之一，所需樣品量少、靈敏度高，是一種環(huán)保、簡(jiǎn)便的分析技術(shù)。

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