許志成 李宏 張群

毛囊干細胞體外誘導分化為血管內皮細胞的實驗研究

許志成 李宏 張群

目的 探討體外誘導人毛囊干細胞成血管內皮細胞的可行性。方法 采用中性蛋白酶（Dispase）分離人毛囊干細胞，用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2誘導液對其誘導，以無誘導因子的基礎培養(yǎng)液為對照組，對每代細胞形態(tài)進行觀察。誘導4代后，檢測vWF（von Willebrand factor）與CD31的表達。結果 在誘導液的作用下，細胞形態(tài)逐步向內皮細胞的鋪路石樣形態(tài)轉變，對照組細胞形態(tài)改變不明顯。至第4代，實驗組已明顯表達vWF與CD31，對照組表達不明顯；流式細胞儀檢測顯示，實驗組陽性表達率近80%，對照組則低于5%；RT-PCR顯示，實驗組表達vWF，對照組未見明顯表達。結論 使用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2誘導液，可在體外誘導人毛囊干細胞分化成血管內皮細胞。

毛囊干細胞 血管內皮細胞 組織工程

血管內皮細胞是構建組織工程化血管主要的種子細胞，來自成年哺乳動物主動脈消化的成熟內皮細胞。由于成熟內皮細胞體外大量擴增技術的不成熟，內皮細胞易老化，與生物材料黏附不牢，易被血流沖走而形成血栓等原因，使組織工程血管的研究受到限制[1]，干細胞可能為解決該問題帶來曙光[2-3]。最近的研究表明，存在于毛囊外根鞘的毛囊干細胞于體外分離純化后，經(jīng)誘導可向多種組織轉化，并有利于組織再生[4-6]。Amoh等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鼠皮膚新生毛細血管可源自毛囊干細胞；Liu等[8]證實，綿羊毛囊干細胞中含有平滑肌前體細胞，純化培養(yǎng)后可形成有收縮功能的平滑肌細胞，說明頭發(fā)毛囊中的干細胞具有形成血管壁細胞的潛力。自體毛囊干細胞來源廣泛，取材時生理干擾?。挥泻軓娫鲋衬芰?，不易老化；體外誘導可多向分化；回植無免疫排斥反應，而成為種子細胞的良好選擇。本實驗分離人毛囊干細胞，采用VEGF和bFGF對其進行體外誘導，觀察細胞在誘導擴增后，表達內皮細胞相關指標的比例，以期為進一步體外血管構建提供種子細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

整形外科手術切除的成人頭皮5例；分離毛囊的器械包括眼科剪刀、鑷子、解剖顯微鏡和顯微器械；中性蛋白酶（Dispase，Gibco公司）；胰蛋白酶（Gibco 公司）；K—SFM（Define Keratinocyte Serum Free Medium）培養(yǎng)液，添加EGF和牛垂體提取物（Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司）；EGM-2培養(yǎng)液（Cambrex公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；維生素 50 mg／L（Sigma 公司）；L-谷氨酰胺 300 mg/L（Sigma公司）；青霉素；鏈霉素（Sigma公司）。 鼠抗人vWF（DAKO 公司），鼠抗人 CD31（DAKO 公司）； 二抗：羊抗鼠 lgG-FITC（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊干細胞的分離與培養(yǎng)

毛囊外根鞘的富集方法參考文獻[9]；毛囊干細胞的富集方法同文獻[10]。

1.2.2 VEGF和bFGF誘導分化毛囊干細胞

將VEGF和bFGF用稀釋液（EGM-2培養(yǎng)液）稀釋成每支1 μg/mL，分裝至Ep管中，-20℃冷凍保存，應用前即時加入，在培養(yǎng)液中的終濃度分別為10 ng/mL和2 ng/mL。取第1代毛囊干細胞進行體外誘導，在細胞全部貼壁后，加入含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及 10%血清的 EGM-2誘導液，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)，隔日更換2/3量的培養(yǎng)液，注意觀察細胞形態(tài)的變化，一般7 d后達到融合狀態(tài)，可繼續(xù)用誘導液傳代培養(yǎng)。當出現(xiàn)血管內皮細胞類似形態(tài)時，可進行內皮細胞特異性表型的鑒定。對照組僅用含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)，與實驗組同期傳代、觀察。

1.2.3 形態(tài)學觀察

倒置相差顯微鏡（Olympus）觀察各代毛囊干細胞形態(tài)變化，以確定在誘導與未誘導的培養(yǎng)情況下，兩組細胞的形態(tài)結構上是否有向內皮細胞發(fā)生轉變的可能。

1.2.4 細胞免疫熒光檢測vWF和CD31的表達

分別收集實驗組第4代細胞與對照組第4代細胞，用丙酮固定15 min，PBS漂洗，10% 羊血清封閉30 min，加入以0.1%BSA稀釋的1:100的vWF和CD31抗體，37℃孵育45 min；PBS漂洗，滴加FITC標記相應二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗。碘化丙啶襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動脈內皮細胞作為陽性對照，人耳廓軟骨細胞為陰性對照。

1.2.5 流式細胞儀檢測陽性細胞表達率

采用胰酶消化法收集實驗組第4代細胞與對照組第4代細胞，消化得細胞懸液，離心5 min制備單細胞懸液，滴加0.25%TritonX-100作用5 min，PBS漂洗，離心5 min；分裝入4個1.5 mL Ep管，保證每管含1×106個以上細胞，其中3管內分別加入抗vWF抗體和抗CD31抗體各10 μL，4℃孵育40 min；PBS漂洗，離心5 min，洗掉未結合抗體；各管同時加入FITC標記的羊抗鼠二抗4 μL，4℃孵育30 min，離心5 min，洗掉未結合抗體。 用只加有FITC標記二抗，而未加一抗的細胞作同型對照，1%多聚甲醛固定后送檢。

1.2.6 RT-PCR 檢測 vWF 表達

實驗分4組：實驗組第4代細胞；對照組第4代細胞；正常內皮細胞作為陽性對照；軟骨細胞作為陰性對照。抽提各組細胞mRNA后按以下逆轉錄反應與聚合酶鏈反應條件進行，反應產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中，在80V電壓下，電泳45 min，條帶與標準條帶位置進行比較，判斷各種檢測目的mRNA的表達。應用天能電泳圖象分析系統(tǒng)在紫外光下觀察各基因表達，以β-actin作為cDNA定量的內參照。根據(jù)GenBank報告的序列設計引物，β-actin上游引物為：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3’； 下游引物為：5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，vWF 上游引物為：5’-CAGTGGTGTGAACGGGCATCT-3’；下游引物為：5’-CCCTGCGTAAGTCCATTCC-3’。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用 t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察

原代毛囊干細胞剛貼壁時仍保持其原有的特性（圖1）。4～5 d后，細胞逐漸伸展，在誘導液的作用下，細胞形態(tài)逐步由小圓形向鋪路石樣轉變。至第4代，內皮樣形態(tài)更加明顯（圖2），呈良好的分化狀態(tài)；未誘導組細胞形態(tài)改變不明顯。

圖1 原代毛囊干細胞形態(tài)學觀察（100×）Fig.1 Morphological observation of FSCs P0(100×)

2.2 細胞免疫熒光檢測

對體外誘導至第4代的毛囊干細胞進行細胞免疫熒光檢測內皮細胞相關指標vWF與CD31（圖3、4），可見細胞呈現(xiàn)綠色熒光表達，即毛囊干細胞經(jīng)誘導后已產(chǎn)生內皮細胞相關指標的表達，而為對照組胞漿熒光表達不顯著。

圖3 誘導后毛囊干細胞表達vWF（200×）Fig.3 Induced FSCs expressed vWF(200×)

圖4 誘導后毛囊干細胞表達CD31（200×）Fig.4 Induced FSCs expressed CD31(200×)

2.3 流式細胞儀檢測

vWF與CD31在原代接種時的表達陽性率分別為（3.25±0.45）%和（2.83±0.36）%，經(jīng)誘導與傳代至第4代，實驗組中陽性率分別為（78.16±2.51）%和（81.58±3.73）%，明顯高于誘導培養(yǎng)前（P<0.05）；對照組中陽性率分別為（4.82±0.74）%和（3.28±0.62）%，明顯低于實驗組（P<0.05）。可見兩種標記在不同組有相似的表達趨勢，即實驗組細胞陽性率明顯高于培養(yǎng)前和對照組（P<0.05）（表1）。

表1 各組流式細胞儀檢測陽性細胞表達率(x±s，n=8)Table 1 Posive cells expressed in each group by FACS(x±s,n=8)

2.4 RT-PCR檢測vWF表達

誘導組和陽性對照（正常血管內皮細胞）在180 bp有明顯條帶，說明有vWF表達（圖5），對照組和陰性對照（軟骨細胞）則無表達，且各組均有內參照物β-actin在318 bp的表達，說明實驗組表達了內皮細胞vWF的指標。

圖5 RT-PCR結果Fig.5 The results of RT-PCR

3 討論

血管內皮細胞是血管內膜的主要成分，隨血流呈單層縱向排列，細胞長軸與血流方向平行。內皮細胞對維持血流的穩(wěn)定，維護血管壁的完整，穩(wěn)定物質交換平衡，參與凝血與抗凝血活動，分泌血管舒縮物質等方面都具有至關重要的作用。血管內皮細胞一般可從大中型的動靜脈中用灌注消化法獲取，自Jaffe等[11]首創(chuàng)從新生嬰兒臍帶培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞后，內皮細胞的培養(yǎng)方法得到了不斷改進。我們發(fā)現(xiàn)，應用終末成熟分化的血管內皮細胞為種子細胞體外培養(yǎng)易老化，擴增效率降低，直接影響到構建血管的力學性能和組織結構。

毛囊組織來源豐富，利用它進行組織工程研究有以下優(yōu)勢：①微創(chuàng)取材，方便且對機體無害；②取自自體，來源充足，誘導的組織不存在組織配型及免疫排斥問題；③分化的組織類型廣泛，有多向分化潛能。毛囊干細胞可在體外大量擴增，若能分化為血管壁細胞，可提供充足的細胞量，從而解決心血管組織工程中的細胞來源問題。

培養(yǎng)液的選擇也直接影響細胞的生長。本實驗采用的是EGM-2培養(yǎng)液，添加物中含有血管內皮細胞生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維母細胞生長因子、胰島素樣生長因子、氫化可的松、肝素、血清與抗生素等，對內皮細胞生長極為有益。其中，各種生長因子配合激素使用，對血管內皮細胞有高效特異的促有絲分裂作用和促增殖作用；肝素可顯著增強生長因子對血管內皮細胞的增殖作用，配合母液的使用，能使體外培養(yǎng)的細胞較好維持內皮細胞的表型及功能，同時避免了尋求添加物與具體用量選擇的不便，節(jié)省了工作時間，提高了工作效率。

在鑒定毛囊干細胞是否誘導為血管內皮細胞時，本實驗選擇了vWF與CD31。前者是內皮細胞特有的超微結構，CD31即血小板內皮細胞黏附分子－1廣泛存在與內皮細胞表面，兩者是判別干細胞是否誘導分化為成熟內皮細胞的重要指標。觀察結果顯示，經(jīng)誘導的毛囊干細胞生長形態(tài)逐漸轉化為鋪路石樣的內皮細胞，對照組則形態(tài)改變不明顯。熒光檢測顯示實驗組細胞呈現(xiàn)綠色熒光表達，可見干細胞已表現(xiàn)內皮細胞的類似結構，而對照組細胞的熒光較弱；RT-PCR從基因水平進一步證實了這點。流式細胞儀檢測表明，實驗組細胞有明顯的內皮細胞標記表達，誘導率近80%，明顯高于對照組表達（近5%），證明本實驗的誘導體系有較高的誘導效率。

本實驗建立了一個較為有效的誘導體系，同時摸索出一套較為完整的毛囊干細胞分離純化培養(yǎng)和表型檢測的方法，誘導后已表達有血管內皮細胞的表型，為進一步進行血管構建與血管缺損的修復研究奠定了基礎，也為血管疾病的治療提供了新的思路與選擇。

[1]曹誼林.組織工程學理論與實踐[M].上海:上?？茖W技術出版社,2004,271.

[2]Badylak SF,Nerem RM.Progress in tissue engineering and regenerative medicine[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(8):3285-3286.

[3]Lasala GP,Minguell JJ.Vascular disease and stem cell therapies[J].Br Med Bull,2011,98:187-197.

[4]Amoh Y,Li L,Campillo R,et al.Implanted hair follle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(49):17734-17738.

[5]Blazejewska EA,Schlotzer-Schrehardt U,Zenkel M,et al.Corneal limbal microenvironment can induce transdifferentiation of hair follicle stem cells into corneal epithelial-like cells[J].Stem Cells,2008,27(3):642-652.

[6]Amoh Y,Kanoh M,Niiyama S,et al.Human hair follicle pluripotent stem(hfPS)cells promote regeneration of peripheral-nerve injury:an advantageous alternative to ES and iPS cells[J].J Cell Biochem,2009,107(5):1016-1020.

[7]Amoh Y,Li L,Yang M,et al.Nascent blood vessels in the skin arise from nestin-expressing hair-follicle cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(36):13291-13295.

[8]Liu JY,Peng HF,Andreadis ST.Contractile smooth muscle cells derived from hair-follicle stem cells[J].Cardiovasc Res,2008,79(1):24-33.

[9]張群,楊光輝,叢笑倩,等.人毛囊外根鞘細胞的分離及培養(yǎng)明[J].組織工程與重建外科,2006,2(2):79-82.

[10]張群,楊光輝,叢笑倩,等.差速貼壁法分選人毛囊干細胞的實驗研究[J].中華實驗外科雜志,2006,23(6):755-757.

[11]Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins:identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest,1973,52(11):2745-2756.

Preliminary Study on Inducing Hair Follicle Stem Cells into Vascular Endothelial Cells in Vitro

XU Zhicheng1,LI Hong2,ZHANG Qun1.1 Department of Plastic&Reconstructive Surgery，The Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Hangzhou Electronic Science and Technology University,Hangzhou 310018,China.

XU Zhicheng(E-mail:xuzhichengmd@163.com).

ObjectiveTo investigate the feasibility of inducing human hair FSCs(follicle stem cells)into VECs(vascular endothelial cells)in vitro.MethodsThe dispase was used to isolate the stem cells and stem cells were cultured in EGM-2 plus 10 ng/mL VEGF and 2 ng/mL bFGF as long as 4thpassage as a experimental group,the control group was cultured in EGM-2 without growth factor.The morphological change of each passage was observed and vWF(von Willebrand factor)and CD31 were tested 4 passages later.ResultsThe morphological change to VECs was obviously found in the increasing passage of the induced FSCs,but the phenomenon was not distinct in the control group.Induced FSCs of 4thpassage expressed vWF and CD31 in immunocytochemical staining,while little expression was observed in the control groups.FCM showed nearly 80%of induced FSCs expressed vWF and CD31,much higher than the control ones which were lower 5%.RT-PCR further confirmed the experimental group expressed vWF,but not obvious expression in the control group.ConclusionFSCs can be induced to VECs in vitro by EGM-2 plus 10 ng/mL VEGF and 2 ng/mL bFGF.

Follicle stem cells;Vascular endothelial cells;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）05－0241－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.001

國家自然科學基金青年科學基金(81000842)。

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科(許志成，張群)；310018 浙江省杭州市 杭州電子科技大學（李宏）。

許志成（E-mail:xuzhichengmd@163.com）。

2012年7月22日；

2012年8月16日）