王正輝 楊壯群 吳寶俊 常會敏 Kamal Mustafa 盧曉云

Aggrecanase-2表達沉默對體外培養(yǎng)的軟骨細胞基質(zhì)代謝的影響

王正輝 楊壯群 吳寶俊 常會敏 Kamal Mustafa 盧曉云

目的 探討RNA干擾蛋白聚糖酶-2（Aggrecanase-2）對大鼠肋軟骨細胞基質(zhì)代謝的影響。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠肋軟骨細胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將針對Aggrecanase-2的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細胞，觀察轉(zhuǎn)染后細胞生長曲線、細胞形態(tài)的變化；RT-PCR檢測Aggrecanase-2 mRNA水平的變化；Western Blot檢測蛋白多糖（Aggrecan）的變化。結果RNA干擾Aggreanase-2對細胞生長速度及形態(tài)無明顯影響，可明顯降低Aggrecanase-2的mRNA表達水平（P<0.05），增加Aggrecan的含量（P<0.05）。結論 抑制Aggrecanase-2可減少蛋白多糖的降解，RNAi是一種有效的研究軟骨細胞基質(zhì)代謝的工具。

軟骨細胞 蛋白聚糖酶-2 RNA干擾

先天性畸形或后天獲得性疾病導致的軟骨組織缺損，如耳、鼻、氣管的缺損或畸形等，嚴重影響患者的顏面外觀或器官功能。軟骨是一種無血管的組織，自身修復能力有限。軟骨組織的來源主要以自體、同種異體和異種軟骨移植物為主。其中，同種異體軟骨為僅次于自體軟骨的良好生物材料，其成本低、來源廣泛且生物學性能良好的優(yōu)點，使其目前在臨床上應用較多，效果良好，臨床成功率可達90%以上[1－2]。同種異體軟骨移植后，軟骨細胞外基質(zhì)（ECM）發(fā)生大量的降解，尤其在移植后1個月內(nèi)最為明顯，表現(xiàn)為基質(zhì)中蛋白多糖（Aggrecan）和膠原的含量發(fā)生較大的變化[1-3]。目前研究認為，Aggrecan的丟失可能是軟骨代謝失衡的始動環(huán)節(jié)。因此，采用RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術下調(diào)軟骨細胞多聚蛋白聚糖酶（Aggrecanase）的表達，減少其對Aggrecan的分解，將有可能保持軟骨移植后軟骨細胞外基質(zhì)的平衡，從而維持軟骨的穩(wěn)定，減少軟骨的吸收。

本實驗以大鼠Aggrecanase-2為靶基因，設計針對Aggrecanase-2特異性的小干擾RNA，并將該載體轉(zhuǎn)染軟骨細胞，觀察其對細胞基質(zhì)代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

慢病毒載體試劑盒（上?？党缮锕荆缓怂醿?nèi)切酶BamHⅠ、核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ（TaKaRa公司）；T4 DNA連接酶（MBI公司）；凝膠回收試劑盒（QIAGEN公司）。雌性SD大鼠（西安交通大學醫(yī)學院動物中心），1 月齡，體質(zhì)量（120±10）g。 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；胰蛋白酶（Sigma公司），Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、阿爾新藍8GX（Sigma公司）；小鼠抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體（Neomarker公司）；羊抗大鼠Aggrecan單克隆抗體（Santa Cruz公司）；DAB免疫組織化學試劑盒（北京中杉公司）；RNA提取試劑盒（上海飛捷公司）；Revertaid First strand CDNA synthesis kit（MBI公司）。正置、倒置相差顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)（Nikon公司）；CO2培養(yǎng)箱等。

1.2 大鼠肋軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

參見文獻[4]的方法。清除附著于軟骨的其他組織，將軟骨切成1 mm3的小粒。0.05%透明質(zhì)酸酶10 mL室溫下消化20 min，棄去酶液，D-Hanks’液洗滌后，將軟骨小粒轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，加入0.2%胰蛋白酶5 mL，于37℃磁力攪拌下消化30 min。再加入0.2%膠原酶5 mL，于37℃振蕩消化過夜，吸出含細胞酶液，200目篩網(wǎng)過濾消化后的細胞懸液，所得細胞沉淀重懸于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中。按2×104cells/cm2的密度，將上述細胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換培養(yǎng)液，以后培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.3 ShRNA重組表達載體的構建[5]

按GenBank數(shù)據(jù)庫大鼠Aggrecanase-2 mRNA（XM_341154）序列，根據(jù)RNAi設計原則設計，挑選3段長19 bp的特異性寡核苷酸為靶序列，命名為ag gre-21043-1061、aggre-21229-1247和 aggre-22293-231，陰性對照為aggre-2neg。

1.4 脂質(zhì)體介導的軟骨細胞轉(zhuǎn)染

將第1代軟骨細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞長至80%～90%融合時轉(zhuǎn)染構建的載體質(zhì)粒。按照LipofectamineTM2000說明書進行。實驗分組為：空白對照、干擾組、陰性對照組。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

將細胞按每孔2×104個細胞接種于24孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。 為避免血清干擾，培養(yǎng)細胞時用小于10%的血清培養(yǎng)；分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h 時，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入 MTT（5 mg/mL）20 μL，另加 180 μL 無酚紅DMEM 37℃繼續(xù)孵育4 h；吸去混合液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩10 min使結晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上490 nm處測定光吸收值，記錄結果。

1.6 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后Aggrecanase-2的表達[6]

按照試劑盒說明提總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA按照以下體系（25 μL體系）進行PCR擴增。

β-actin引物序列：正義鏈5'-GAGGGAAA TCGTGCGTGAC-3'；反義鏈 5'-TAGGAGCCA GGGCAGTAATCT-3'；反應條件是 94 ℃ 2 min，94 ℃30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循環(huán) 35 次。

Aggrecanase-2引物序列：正義鏈5'-CTGC GCTGTGATTGAAGATGAT-3'；反義鏈 5'-TGCTGGT AAGGATTGAAGACATT-3'；反應條件是94℃2 min，94 ℃ 30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循環(huán) 35 次。反應產(chǎn)物于1%凝膠中進行電泳。凝膠成像系統(tǒng)對各電泳條帶的吸光度進行分析，得出Aggrecanase-2 mRNA的相對表達量。

1.7 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后Aggrecan的表達

轉(zhuǎn)染后48 h，加入單去污細胞裂解液，在4℃以12 000 r/min離心3 min，取上清，用 Lowry法定量蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)置 PVDF膜上，依次加入封閉液、抗Aggrecan抗體、辣根過氧化物酶標記二抗，再經(jīng)化學發(fā)光劑反應，X線片壓片曝光。

1.8 統(tǒng)計學方法

各取3個樣本，每個樣本重復3次。采用SPSS 10.0軟件包，對實驗數(shù)據(jù)進行配對t檢驗和組間方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT

各組質(zhì)粒干擾后與對照組相比，細胞生長曲線無明顯變化（圖1）。

圖1 各組質(zhì)粒干擾后生長曲線Fig 1.The growth curve of chondrocytes by different plasmids

2.2 RNAi對Aggrecanase－2 mRNA水平影響

RT-PCR檢測結果表明：細胞中各組泳道中βactin基因擴增片段條帶的亮度強弱相似，說明RTPCR中加入的模板的量一致，而擴增的Aggrecanase-2基因電泳帶存在明顯差異。其中對照及陰性對照組PCR擴增帶亮度較強，3組重組質(zhì)粒載體中，RNAi后Aggrecanase-2表達與對照組相比，aggre-21043-1061表達量為對照組的 60%（P<0.05），aggre-21229-1247組為 71.64%（P<0.05），而 aggre-22293-2311對 Aggrecanase-2無明顯抑制作用，陰性對照組對Aggrecanase-2也無明顯影響，說明RNAi抑制的特異性（圖2）。

抑制率=（相對灰度值對照組－相對灰度值實驗組）÷相對灰度值對照組

圖2 RT-PCR產(chǎn)物電泳及統(tǒng)計圖（★★P＜0.01）Fig 2.RT-PCR results and graph of statistics(★★P＜0.01)

2.3 Western Blot分析

采用Western Blot檢測干擾后的Aggrecan含量，發(fā)現(xiàn)aggre-21043-1061和aggre-21229-1247可明顯增加Aggrecan含量，與對照組有統(tǒng)計學差異（P<0.05）（圖3），與RT-PCR結果一致。

圖3 Western-blot條帶圖Fig 3.The graph of Western Blot

3 討論

同種異體軟骨移植后，常發(fā)生免疫排斥反應，導致移植軟骨被吸收和破壞。軟骨組織是由少量細胞和大量基質(zhì)成分組成的，具有抗原性，但其細胞外基質(zhì)（ECM）能阻止分子量大于60 000的宿主大分子滲透、通過，隔離了軟骨細胞與宿主間的大分子（如免疫球蛋白）之間的接觸作用，形成了一道抗免疫反應屏障，保護和預防或延緩宿主免疫移植排斥反應，使軟骨成為一種弱抗原組織。因此，維持軟骨基質(zhì)的質(zhì)和量，對軟骨移植物的存活顯得非常重要。目前，減少軟骨移植后的免疫排斥反應尚是難點問題。

楊壯群等[1-2]在同種異體軟骨移植中發(fā)現(xiàn)，同種異體軟骨移植后，軟骨ECM大量衰退（尤其在移植后1個月內(nèi)最為明顯），主要表現(xiàn)為單核淋巴細胞的浸潤導致蛋白多糖的大量降解，隨后因MHCⅡ型分子的滲入使Ⅱ型膠原流失。軟骨移植后基質(zhì)的變化首先表現(xiàn)為蛋白多糖的喪失，這一軟骨細胞外基質(zhì)降解過程與骨關節(jié)炎的病理過程相類似。有關學者在研究類風濕性關節(jié)炎（RA）和退行性關節(jié)炎（OA）時發(fā)現(xiàn)，多聚蛋白聚糖的丟失是目前所知的關節(jié)軟骨在關節(jié)疾病中最早發(fā)生的代謝變化，甚至早于關節(jié)軟骨出現(xiàn)病理改變[7]。致病因素所導致的多聚蛋白聚糖的丟失，可視為軟骨代謝失衡的始動環(huán)節(jié)，如持續(xù)存在，則引起關節(jié)軟骨膠原纖維的降解和各種炎性信息因子的釋放，引發(fā)瀑布效應，進而徹底打破關節(jié)軟骨的代謝平衡，進入不可逆性的負代謝狀態(tài)，最終導致關節(jié)軟骨的損毀。因此，多聚蛋白聚糖的代謝改變和信息調(diào)控是研究軟骨基質(zhì)代謝障礙的關鍵所在。

參與多聚蛋白聚糖代謝的生物大分子很多，其中參與降解代謝的最重要的酶是多聚蛋白聚糖酶。Aggrecanases屬于帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整連蛋白金屬蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinasewith thrombospondin motifs，ADAMTS）家族，主要降解軟骨多聚蛋白聚糖，具有很高的特異性。其公認的成員只有兩個，即Aggrecanase-1和Aggrecanase-2。Aggrecanase-2在新生關節(jié)軟骨蛋白聚糖的代謝中起重要作用，并且在關節(jié)軟骨受到病理損害時，對蛋白聚糖的降解、糖氨聚糖（Glycossminoglycan，GAG）的丟失起主要責任。目前，Aggrecan因其為軟骨降解的始動因素而受到廣泛的關注，Aggrecanases已成為減少軟骨降解新的靶點[8]。

RNAi是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術具有穩(wěn)定性好、阻斷效率高、特異性強的特點，現(xiàn)已成為操縱微生物和培養(yǎng)哺乳動物細胞基因表達的強有力工具。Ruohua等[9]采用RNAi技術應用于人軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)通過抑制ADAMTS可明顯減少蛋白多糖的降解。本研究中，我們采用大鼠肋軟骨細胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)表達shRNA的載體可明顯抑制Aggrecanase-2的mRNA水平，并可增加Aggrecan含量，與對照組相比差異顯著，aggre-21043-1061為最有效的RNA特異性抑制序列，同時觀察到抑制Aggrecanase-2對軟骨細胞生長速率無明顯影響，為構建Aggrecanase-2受抑制的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞奠定了基礎。

當然，軟骨移植抑制后的免疫排斥反應是個復雜的過程，不僅與自身軟骨組織、軟骨細胞代謝情況相關，還與炎性因子等有關。此外，Aggrecanase-2、MMPs等降解酶活性狀態(tài)啟動的始動因素，可能涉及到諸多方面的問題。是否可通過抑制Aggrecanase-2而減少Aggrecan的降解，以減緩排斥反應的發(fā)生，尚需更深入的研究。

[1]鄭信民,楊壯群,侯成群,等.同種透明軟骨移植后蛋白多糖動態(tài)變化的實驗觀察[J].中華整形外科雜志,1995,11(2):129-131.

[2]侯成群,楊壯群,常曉峰,等.同種軟骨移植后膠原含量變化的研究[J].中華整形外科雜志,1995,11(4):274-276.

[3]楊壯群,侯成群,常曉峰,等.同種軟骨移植后基質(zhì)動態(tài)變化的實驗研究[J].中國美容醫(yī)學雜志,1997,6(1):14-16.

[4]Wang ZH,Yang ZQ,He XJ.Lentivirus-mediated knockdown of aggrecanase-1 and-2 promotes chondrocyte-engineered cartilage formation in vitro[J].Biotechnology and Bioengineering,2010,107(4):730-736.

[5]Wang ZH,Yang ZQ,He XJ,et al.Effects of RNAi-mediated inhibition of aggrecanase-1 and aggrecanase-2 on rat costochondral chondrocytes in vitro[J].Acta Pharmacol Sin 2008,29(10):1215-1226.

[6]王正輝,李國光,楊壯群,等.大鼠肋軟骨細胞體外培養(yǎng)及老化對基質(zhì)代謝的影響[J].組織工程與重建外科,2007,3(6):312-316.

[7]Nagase H,Kashiwagi M.Aggrecanases and cartilage matrix degradation[J].Arithritis Res Ther,2003,5(2):94-103.

[8]Elizabeth CA,Michael AP,Carlp D,et al.Tortorella.Aggrecanase.A target for the design of inhibitors of cartilage degradation[J].Ann NY Acad Sci,1999,30(878):92-107.

[9]Song RH,Micky DT,Anne-Marie M,et al.Aggrecan degradation in human articular cartilage explants is mediated by both ADAMTS-4 and ADAMTS-5[J].Arthritis Rheum,2007,56(2):575-585.

Effects of Inhibiting Aggrecanase-2 Gene Expression by RNA Interference on Cultured Chondrocyte Extracellular Matrix in Vitro

WANG Zhenghui1,YANG Zhuangqun2,WU Baojun1,CHANG Huimin1,Kamal Mustafa3,LU Xiaoyun4.1Department of Otolaryngology-Head&Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;2 Department of Plastic and Burns Surgery,The First Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China;3 Faculty of Dentistry,University of Bergen,Norwa;4 Department of Biological Science and Bioengineering,School of Life Science and Technology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China.

ObjectiveTo evaluate the effect of RNAi mediated aggrecanase-2 on rat costochondral chondrocytes extracelluler matrix.MethodsRat costochondral chondrocytes were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of chondrocytes were observed after transfection.The mRNA of aggrecanase-2 expression was detected by RT-PCR method and aggrecan content was detected by western blot.ResultsThe specific inhibition of aggrecanase-2 by RNAi had no positive effect on the morphology and growth velocity of the chondrocytes.The express of mRNA of aggrecanase-2 was decreased significantly.RNAi significantly increased the aggrecan content of chondrocytes treated.ConclusionInhibition of aggrecanase-2 may decrease aggrecan degradation.RNAi technology can be a useful tool for studying degenerative processes in cartilage.

Chondrocyte;Aggrecanase-2;RNA interference

Q786

A

1673－0364（2012）05－0245－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.002

國家自然科學基金（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（西安交通大學國際合作類，交叉學科類）；西安交通大學第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)基金[RC(XM)201102]；西安交通大學第二附屬醫(yī)院重點項目基金[YJ(ZD)201103]。

710004 陜西省西安市 西安交通大學第二附屬醫(yī)院耳鼻喉-頭頸外科（王正輝，吳寶俊，常會敏）；710061 陜西省西安市 西安交通大學第一附屬醫(yī)院整形燒傷科（楊壯群）；挪威卑爾根大學牙科學院（Kamal Mustafa）；710049 陜西省西安市 西安交通大學生命科學與技術學院（盧曉云）。

吳寶俊（E-mail:ehui4298@163.com）。

2012年8月5日；

2012年8月22日）