宋仁剛

ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及意義

宋仁剛

目的 體外研究鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞（MTSF）發(fā)生老化時(shí)，ANGPTL－1中的表達(dá)及意義。方法 分別收集不同年齡原代鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞，并檢測(cè)老化細(xì)胞的COL1、COL3及透明質(zhì)酸合成量。用RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中ANGPTL－1基因及膠原蛋白與透明質(zhì)酸含量。結(jié)果 ANGPTL－1基因在青年組鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于老年組（P＜0.01）；老年組成纖維細(xì)胞COL1、COL3及透明質(zhì)酸合成量顯著低于青年組成纖維細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)論ANGPTL－1基因可能是延緩鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞老化的重要基因之一，可應(yīng)用于皮膚抗衰老的研究。

血管生成素樣蛋白 老化 皮膚成纖維細(xì)胞 膠原蛋白 透明質(zhì)酸（HA）

皮膚組織會(huì)不可避免的出現(xiàn)老齡化變化。臨床表現(xiàn)為皮膚失水，皺紋增加，皮膚松弛，彈性下降；組織學(xué)上表現(xiàn)為皮膚膠原纖維和彈性纖維斷裂，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）含量減少。皮膚膠原蛋白及透明質(zhì)酸由真皮層內(nèi)的成纖維細(xì)胞的合成[1]。因此，探索皮膚衰老的相關(guān)因素，篩選相關(guān)基因，有望成為對(duì)抗皮膚老化的又一途徑。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，我們篩選了出了血管生成素樣蛋白（ANGPTL）-1基因。在老年組小鼠與青年組小鼠中，ANGPTL-1基因的表達(dá)存在顯著性差異（P<0.01），而關(guān)于ANGPTL1基因與皮膚老化關(guān)系，目前仍缺乏相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 成纖維細(xì)胞收集

分別選取5月齡和 30月齡的小鼠各10只，分別記為青年組與老年組。標(biāo)本取自鼠尾的皮膚。收集皮膚標(biāo)本，以0.25%DispaseⅡ于4℃下消化8～11 h，用眼科鑷子掀去表皮，保留真皮組織，用PBS清洗3次，剪碎，加入0.1%復(fù)合膠原酶，37℃消化4 h，100目無(wú)過(guò)濾，收集濾液，離心 10 min（1 000 r/min），去上清，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM重懸。備用。

1.2 RT-PCR檢測(cè)

收集青年小鼠與老年小鼠尾部皮膚成纖維細(xì)胞，提取總RNA時(shí)根據(jù)指示使用TRIzol試劑盒（Invitrogen公司）。以MQ水作為空白對(duì)照，分別記錄RNA濃度及A260 nm/A280 nm。用反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）分離RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA。目的基因在Pubmed中得到序列號(hào)，通過(guò)使用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) ANGPTL-1、COL1、COL3 和內(nèi)參GAPDH的引物。然后使用PCR擴(kuò)增的Taq酶試劑盒（TaKaRa公司）及引物（由生工合成）加至 25 μL體積進(jìn)行反應(yīng)。

1.3 ELISA分析測(cè)量透明質(zhì)酸

收集各組分第7天的培養(yǎng)液進(jìn)行COL1、COL3和HA的ELISA檢測(cè)，ELISA試劑盒（R&D systems公司）。按說(shuō)明書(shū)加標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和待檢測(cè)樣品，按設(shè)計(jì)孔位加入96孔板，100 μL/孔。按說(shuō)明書(shū)操作，除空白組外均加入50 μL的檢測(cè)緩沖液。混勻，37℃恒溫孵育30 min。孵育之后棄液，用緩沖液沖洗4次，每孔加100 μL的有效酶。混勻后，加蓋，37℃孵育30 min。然后，用沖洗緩沖液將檢測(cè)板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。避光室溫孵育5 min，加入50 μL的反應(yīng)終止溶液終止反應(yīng)。15 min內(nèi)，在405 nm波長(zhǎng)下觀察吸光率，測(cè)出HA的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.01被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中信息搜索結(jié)果

在青年組（n=10）小鼠皮膚細(xì)胞中，ANGPTL基因表達(dá)明顯高于老年組（n=10）（P<0.01）（圖1）。

圖1 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中信息搜索結(jié)果Fig.1 The research results in net data base

2.2 RT-PCR檢測(cè)

圖2 RT-PCR檢測(cè)Fig.2RT-PCR

如圖2所示，1泳道為青年組小鼠 HA基因表達(dá)，2、6泳道為Marker，3泳道為青年組COL1表達(dá)，4泳道為老年組COL1表達(dá)，5泳道為老年組HA基因表達(dá)，7泳道為青年組COL3表達(dá)，8泳道為老年組COL3表達(dá)，9泳道為青年組ANGPTL－1基因表達(dá)，10泳道為老年組ANGPTL1基因表達(dá)。

RT-PCR結(jié)果顯示，隨著小鼠年齡的增加ANGPTL基因的表達(dá)逐漸降低。

2.3 透明質(zhì)酸ELISA測(cè)量

培養(yǎng)至第7天的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液分析發(fā)現(xiàn)，伴隨小鼠年齡的降低細(xì)胞合成的Ⅰ、Ⅲ型膠原（COL1、COL3）與 HA 量均有增加的趨勢(shì)（P<0.05）。ELISA測(cè)定透明質(zhì)酸功能變化結(jié)果顯示，其合成的膠原和透明質(zhì)酸量也伴隨ANGPTL－l基因的表達(dá)的降低而顯著降低，并呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性（圖3）。

圖3 ELISA測(cè)量Fig.3 ELISA

3 討論

血管生成素樣蛋白（ANGPTL）-1是血管生成素相關(guān)蛋白家族的成員，具有調(diào)制血管生成的作用。

透明質(zhì)酸與膠原蛋白是人體真皮組織中的重要組成部分，隨著紫外線的不斷照射以及人年齡的增加，皮膚內(nèi)透明質(zhì)酸與膠原蛋白的含量逐漸減低，真皮組織被氧化、皮膚塌陷、萎縮。皮膚在外觀上表現(xiàn)為粗糙、干燥、皺紋增大、松弛等一系列衰老征象。

近年來(lái)，在關(guān)于皮膚發(fā)生老化的研究中，皮膚成纖維細(xì)胞已經(jīng)成為研究重點(diǎn)[2]，研究?jī)?nèi)容包括老化時(shí)細(xì)胞的基因[3-4]，受體改變[5]，相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化等領(lǐng)域[6-7]。

RT-PCR結(jié)果顯示，隨著小鼠年齡的增加ANGPTL－l基因的表達(dá)逐漸降低。ELISA測(cè)定透明質(zhì)酸功能變化結(jié)果顯示，其合成的膠原和透明質(zhì)酸量也伴隨ANGPTL基因的表達(dá)的降低而顯著降低，并呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ANGPTL-1基因可能是延緩鼠尾皮膚成纖維細(xì)胞老化的重要基因之一，可應(yīng)用于皮膚抗衰老的研究。然而，ANGPTL-1基因通過(guò)何種機(jī)制參與皮膚老化的調(diào)控，尚需進(jìn)行深入研究。

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The Expression and Meaning of ANGPTL1 Gene in Skin Fibroblast of Aging Mouse Tail

SONG Rengang.Department of Plastic Surgery,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China.

ObjectiveTo explore the expression of ANGPTL－1 gene,collagen and hyaluronic acid(HA)in skin fibroblast of aging mouse tail in vitro.MethodsPrimary mouse skin fibroblasts were collected in young and old mouse group.RTPCR was used to measure expression of collagen and hyaluronic acid.ResultsRT-PCR assay showed that the express of ANGPTL1 is higher in young group than in loder group.There was significant differene between 2 groups (P<0.01).ConclusionANGPTL－1 may be used as an effective factor to delay skin aging.

ANGPTL－1;Aging;Fibroblast;Collagen;Hyaluronic acid(HA)

Q786

A

1673－0364（2012）05－0269－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.006

518020 廣東省深圳市 深圳市人民醫(yī)院整形外科。

2012年8月12日；

2012年9月20日）