張 平

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院分院職業(yè)病科，山東 泰安 271000)

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是所有原核細胞和真核細胞在生理、病理及環(huán)境因素(高溫、缺氧或病毒感染)下均可產(chǎn)生的一組高度保守的蛋白質(zhì)分子家族。近年的研究發(fā)現(xiàn)，HSP與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤免疫與治療以及機體對腫瘤治療藥物耐藥性的發(fā)生和腫瘤的預(yù)后等都有密切關(guān)系[1]。對骨肉瘤患者進行微波原位熱療，治療后HSP70的表達率(30%～40%)較治療前(2%)明顯增高，且表達的強度也顯著增強[2]。但是目前，有關(guān)熱療對于HSP及腫瘤影響研究的溫度主要集中于42℃～45℃和60℃以上這兩個區(qū)域，對于(50±1)℃對HSP與腫瘤細胞的作用研究甚少，本實驗通過觀察同一熱療溫度即50℃時不同熱療時間對體外培養(yǎng)各腫瘤細胞熱休克蛋白表達的影響，目的在于探討各腫瘤細胞對熱耐受的敏感程度，為HSP在熱療對腫瘤的治療中發(fā)揮更重要的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 慢性髓系白血病敏感型細胞株(K562/S細胞)、人胃癌AGS細胞株(AGS細胞)、BALB/c小鼠來源的結(jié)腸癌細胞CT-26株(CT-26細胞)、乳腺癌藥物敏感細胞株MCF(MCF細胞)均由泰安市中心醫(yī)院中心實驗室提供。細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 HSP70一抗：武漢博士德生物工程有限公司；HSP70SP免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。0.4%多聚甲醛、PBS緩沖液、RPMI-1640完全培養(yǎng)基、無水乙醇、二甲苯、蘇木素染色劑、蒸餾水、中性樹脂封片劑； 5%胰蛋白酶：GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清：杭州四季青生物公司。

1.1.3主要儀器 普通倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus IX70)；日本三洋MCO-175型CO2孵箱；電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠，GB11240型號LSY)；超速離心機(美國Sigama公司，3-18K)；超凈工作臺(蘇州，SW-CT-1F)；封口膜、精確水銀溫度計、6孔板、蓋玻片。

1.2方法

1.2.1細胞爬片的制作 取對數(shù)生長期的各腫瘤細胞胰蛋白酶消化(40 s)后加入10%RPMI-1640完全培養(yǎng)基，調(diào)制成2×105/ml，的細胞懸液，然后加入到內(nèi)置6片蓋玻片并已高壓滅菌的6孔板中，置于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)約24小時至48小時，待細胞爬片至滿片的2/3時用于實驗 (K562/S細胞除外，為細胞涂片) 。

1.2.2分組 將各細胞爬片分為實驗組(50℃加熱)和對照組(37℃加熱)。實驗組：待細胞爬片至滿片的2/3時，取出6孔板，密封，在50℃水浴中加熱各時間段(5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、50分鐘加熱組)。對照組：將同樣的細胞爬片在37℃水浴放置各時間段(5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、50分鐘)。

1.2.3熱療方法 打開電熱恒溫水浴鍋，將溫度調(diào)節(jié)為50℃，并以精確水銀溫度計檢測調(diào)節(jié)，每10分鐘測量一次，直至其穩(wěn)定在50℃。然后放入封閉的六孔板2分鐘后開始計時，分別于每個加熱時間點到達后取出六孔板，去除外封物，在無菌實驗臺內(nèi)吸去培養(yǎng)基，另加入新鮮培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(K562/S細胞為加熱各時間段，復(fù)溫24小時后，做成細胞涂片)。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測HSP70的蛋白表達 主要步驟為：復(fù)溫治療24 h后取出6孔板內(nèi)的細胞爬片PBS沖洗，0.4%多聚甲醛固定 (室溫1 h)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，然后依次滴加封閉羊血清(A劑，藍色)，HSP70一抗，二抗(B劑，黃色)，辣根酶標記(C劑，橙色)，以DAB顯色，經(jīng)蘇木素輕度復(fù)染、常規(guī)脫水、透明和封片后, 于顯微鏡下觀察并照相。陽性細胞的胞漿胞核染色呈棕黃色。計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù)，隨機選擇5個視野，計算均值×100%為陽性細胞的比率。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 實驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料利用ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)間的多重比較采用SNK法，顯著性水平取α=0.05。

2 結(jié) 果

將各腫瘤細胞加熱，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，未進行熱療的細胞HSP70表達較低，為2%左右，熱療后HSP70的表達量明顯提高，且表達強度與加熱時間有較大的相關(guān)性。

50℃時，HSP70的陽性表達率隨時間的延長而提高，直至細胞受熱損傷嚴重未有表達功能而停止(表1)。以AGS細胞為例加熱5 min、10 min、20 min時，HSP70的陽性率依次升高，5 min時平均為20%，10 min時平均為36%，20 min時平均為96%，且表達的強度依次增加。但當(dāng)加熱到30分鐘時HSP70的陽性表達率反而明顯下降，為24%，當(dāng)加熱到50分鐘時HSP70的陽性表達率更加下降，為2%，此條件下HSP70的陽性表達率較低可能是因為細胞受熱而損傷較嚴重，未來得及表達HSP70即死亡所致(圖1)。其它腫瘤細胞HSP70的陽性表達率總趨勢與AGS細胞相似，均是在20 min時達到HSP70的陽性表達率的最高值，只是各時間段不同的腫瘤細胞HSP70表達的量有所差別，但差別沒有顯著性意義(P>0.05)。

表1 50℃ 加熱不同時間4種細胞HSP70的陽性表達率(%)

50℃×5 min(陽性表達率20%)

50℃×20 min(陽性表達率96%)

50℃×30 min(陽性表達率24%)

50℃×50 min(陽性表達率2%)

3 討 論

近年研究表明，熱療可以在腫瘤的放、化療中起到良好的增敏作用，但在廣泛的臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，隨熱療重復(fù)次數(shù)的增加，熱療效果反而下降，會出現(xiàn)所謂“熱耐受(thermotolerance) 或者誘發(fā)熱抗拒”現(xiàn)象，有研究表明腫瘤細胞的熱耐受與熱休克蛋白家族有關(guān), 尤其與熱休克蛋白70(HSP70)的關(guān)系密切[3]。HSP70的高度表達可提高腫瘤細胞的熱耐受性[4]。Roccheri 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，熱耐受現(xiàn)象的發(fā)生與HSP70的誘導(dǎo)表達相關(guān)。熱耐受不是細胞固有的特性，它不遺傳，是一種暫時現(xiàn)象，可能是熱療過程中腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生的某些物質(zhì)降低了細胞對熱的敏感性。腫瘤細胞的熱應(yīng)激反應(yīng)后，最根本的變化是蛋白質(zhì)譜的改變，表現(xiàn)為正常蛋白質(zhì)合成被抑制，卻合成了一組特殊的高度保守的蛋白質(zhì)HSP或稱為應(yīng)激蛋白。HSP是高熱誘導(dǎo)的一種適應(yīng)性蛋白，屬于一種分子伴侶，主要功能在于當(dāng)細胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，可糾正新合成蛋白質(zhì)的折疊和空間構(gòu)象錯誤，協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，抵抗應(yīng)激原引起的變性， 維持生理平衡，降低高熱誘導(dǎo)的細胞凋亡[6]。近年研究表明，HSP70作為蛋白成熟過程中的分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的合成、加工、折疊及轉(zhuǎn)運等過程。HSP70在HSP家族的眾多成員中，是最出色的熱耐受預(yù)測因子[7]。加熱過程中，伴隨HSP70水平的升高，正常蛋白質(zhì)合成受到不同程度的抑制。隨著HSP70的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)的生物合成逐漸恢復(fù)，腫瘤細胞的自我保護機制開始啟動，從而引起腫瘤細胞對熱的敏感性下降。在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，在加熱溫度低于43℃(如溫和熱療即加熱溫度為42℃)或時間過長時，腫瘤細胞更易發(fā)生熱耐受[8]。崔曉波等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌CA9-22細胞在受到熱刺激后(42℃)，HSP70在基因和蛋白水平上均明顯升高，熱療后2～4 h即明顯升高達到最高水平。一般而言，加熱的溫度偏低，時間越長，越易形成熱耐受。如39℃～42℃加溫時，加熱2～3小時，在加熱過程中即可誘發(fā)熱耐受[10]。為此，可通過提高加熱溫度或減少加熱時間來減少HSP70的表達,以避免腫瘤熱療過程中產(chǎn)生熱耐受。

本實驗表明，未進行熱療的細胞HSP70表達較低，為2%左右，熱療可以促進離體各腫瘤細胞HSP70表達增加，當(dāng)加熱溫度一定時，HSP70的陽性表達率和表達強度隨時間的延長而提高，在加熱到10分鐘時各腫瘤細胞中HSP70陽性表達尚不十分強(31%～40%)，說明此時尚未產(chǎn)生“熱耐受”，在加熱到20分鐘時各腫瘤細胞中HSP70強陽性表達，但在加熱30分鐘后細胞大量壞死，HSP70陽性表達逐漸減弱，在50分鐘時HSP70陽性表達基本消失。本實驗為臨床上如何避免腫瘤熱療過程中產(chǎn)生熱耐受提供了一定的實驗依據(jù)。

[1] 顏士巖，張東生．熱休克蛋白在腫瘤治療領(lǐng)域中的研究進展[J]．醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2005，18(1)：59-62．

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