王兆輝 王學(xué)春

(泰山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 泰安 271000)

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)屬性之一，也是患者死亡的主要原因。臨床資料表明，Notch1分子與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌患者原發(fā)癌組織中，轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中的Notch1分子表達(dá)水平存在顯著差異，并且與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。近些年發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞遷徙性增強(qiáng)是導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移的根源。Notch1分子可能通過(guò)促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖，以及增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞的遷徙活性促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

1 Notch分子簡(jiǎn)介

Notch是一個(gè)約300 kDa的單次I型跨膜蛋白，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)是與其配體結(jié)合而激活信號(hào)通路的部分，當(dāng)配體與受體結(jié)合后受體暴露出TACE金屬蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，在TACE金屬蛋白酶作用下胞外部分發(fā)生水解，裂解片段N段部分(胞外部)被配體表達(dá)細(xì)胞內(nèi)吞，C端裂解片段在γ-分泌酶的作用下發(fā)生二次水解，釋放Notch受體的活化形式 (NICD/ICN)，NICD/ICN片段經(jīng)過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA結(jié)合蛋白CSL/CBFI/RBP-Jκ結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因(Hes、Hey)的轉(zhuǎn)錄。在哺乳動(dòng)物中，Notch受體可以分為四個(gè)類(lèi)型：notch1～4。人的Notch配體種類(lèi)有Dlll、3、4和Jaggedl、2等共五種。

Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、成體干細(xì)胞的自我更新或其沿著特定系譜方向分化等方面起著重要的調(diào)控作用。受細(xì)胞周?chē)h(huán)境和發(fā)育環(huán)境雙重作用，Notch信號(hào)通路直接決定細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及遷移。因此，Notch信號(hào)通路對(duì)于維持機(jī)體正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)起著十分重要的作用。

但是Notch信號(hào)通路的異常激活卻與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自1991年首次在人類(lèi)T淋巴母細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)Notch受體的異常表達(dá)外，以后又在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、髓母細(xì)胞瘤和黑色素瘤等許多系統(tǒng)的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路異常激活[1-4]。

2 Notch1分子在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用

最早在研究小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)感染導(dǎo)致乳腺癌模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，MMTV逆轉(zhuǎn)錄DNA序列會(huì)整合到小鼠Notch4基因中，導(dǎo)致Notch4蛋白的異常表達(dá)[5]。后來(lái)研究者將編碼Notch4胞內(nèi)片段(NICD/ICN)的基因序列導(dǎo)入小鼠體內(nèi)并使其表達(dá)，結(jié)果小鼠發(fā)生了乳腺癌，并且很快轉(zhuǎn)移到肺[6]。以后的研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)乳腺癌發(fā)展進(jìn)程中，無(wú)論是乳腺原位癌還是浸潤(rùn)性乳腺癌都有Notch信號(hào)通路的異常激活，包括在導(dǎo)管內(nèi)原位癌和浸潤(rùn)性乳腺癌都有Notch受體過(guò)表達(dá)[7]，在浸潤(rùn)性乳腺癌中存在高水平的Notch配體[8-9]、Notch下游靶基因(hes或hey)的轉(zhuǎn)錄以及Notch的抑癌基因Numb失表達(dá)[10]，提示Notch信號(hào)通路異常激活在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而且Notch1分子與乳腺癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等許多腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-14]。在乳腺癌患者原發(fā)癌組織中，轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中的Notch1分子表達(dá)水平存在顯著差異，并且與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[15]。相反，使用添加Notch信號(hào)通路阻斷劑飼養(yǎng)移植模型鼠，或者對(duì)其所接種的乳腺癌干細(xì)胞沉默Notch1基因表達(dá)，都可以明顯減少移植瘤的發(fā)生[16]。

花本林等[17]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)60例乳腺癌組織和25例癌旁正常乳腺組織Notch1和Jag1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)人類(lèi)乳腺癌中廣泛存在Notch1和Jag1的高表達(dá),而在癌旁正常乳腺組織呈現(xiàn)Notch1和Jag1的低表達(dá)和不表達(dá)，并且Notch1表達(dá)水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期呈正相關(guān)。Reedijk M等[11]應(yīng)用原位雜交技術(shù)分析了Notch相關(guān)配體受體在184例人乳腺癌組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌預(yù)后差的病理亞群中存在Notch1和Jag1的高表達(dá)，Notch1、Jag1的高表達(dá)患者生存期會(huì)縮短。而且如果乳腺癌組織Notch1和Jag1二者水平都較高，患者5年生存率明顯下降。Farnie G等[18]發(fā)現(xiàn)，如果乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織Notch1受體細(xì)胞內(nèi)片段NICD高表達(dá)，患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間會(huì)縮短，約為術(shù)后5年。這些發(fā)現(xiàn)表明，Notch1是重要的促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子。

3 Notch1促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制

癌干細(xì)胞理論認(rèn)為，在腫瘤組織中存在一類(lèi)特殊細(xì)胞，移植到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)可以增殖形成新的瘤組織，并且該瘤組織在細(xì)胞形態(tài)、組織學(xué)類(lèi)型、特異性抗原的表達(dá)方面都與原發(fā)瘤完全一致。這類(lèi)細(xì)胞通過(guò)自我更新和增殖，維持自身在機(jī)體中穩(wěn)定存在，通過(guò)向其他不同瘤細(xì)胞亞群分化重新形成腫瘤組織[19]。 2003年，Al-Hajj等[20]首次分離出表型為CD44+/CD24-/low/ESA+的人乳腺癌干細(xì)胞，以200個(gè)的數(shù)目注射到裸鼠體內(nèi)，形成了有親代異質(zhì)性的移植瘤，而非該表型細(xì)胞致瘤性卻極差。以后Balic等[21]在早期乳腺癌患者骨髓中發(fā)現(xiàn)，一些散在的瘤細(xì)胞呈CD44+/CD24-/low表型。提示CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌干細(xì)胞還具有很強(qiáng)的遷徙活性。 有遷徙活性的乳腺癌干細(xì)胞無(wú)疑是導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的“根源”。而Notch1分子通過(guò)作用于乳腺癌干細(xì)胞，影響其存活、增殖、遷移等活性，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

3.1Notch1分子促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖，維持乳腺癌干細(xì)胞表型

由于已分化的細(xì)胞生活周期短，無(wú)法完成多個(gè)基因變異的積累，而干細(xì)胞具有自我更新、長(zhǎng)期存活和相對(duì)無(wú)限增殖等特點(diǎn)，可以為多基因突變積累提供足夠時(shí)間，因此很多學(xué)者認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于正常干細(xì)胞，并具有干細(xì)胞很多特征性屬性[19-22]。Notch分子是參與調(diào)控干細(xì)胞分化的受體蛋白，正常乳腺細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，而在乳腺癌干細(xì)胞中，Notch信號(hào)相關(guān)分子呈異常高表達(dá)[7]。Notch1分子對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的產(chǎn)生起著重要作用。McGowan等[16]發(fā)現(xiàn)，和普通未作任何處理的乳腺癌干細(xì)胞組相比，將沉默Notch1基因的乳腺癌干細(xì)胞導(dǎo)入小鼠體內(nèi)后，移植瘤發(fā)生率明顯下降。

Notch1分子促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的存留時(shí)間和濃度，增加乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)。Farnie G等[18]利用細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+/CD24-/low從乳腺癌患者體內(nèi)分離乳腺癌干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Notch基因在乳腺癌干細(xì)胞呈高異常表達(dá)。他們利用無(wú)粘連微球懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)乳腺癌干細(xì)胞，這些乳腺癌干細(xì)胞可以形成懸浮無(wú)粘連微球。加入γ-分泌酶抑制劑DAPT、Notch4封閉抗體能夠減少微球的形成。Kondratyev M等[23]從ERBB2小鼠乳腺癌組織分離出乳腺癌干細(xì)胞，這些細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)下形成無(wú)粘連微球，當(dāng)加入γ分泌酶抑制劑MRK-003后，微球的生成減少。這些經(jīng)MRK-003處理的細(xì)胞移植到同源小鼠體內(nèi)不能形成移植瘤。MRK-003還可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或者凋亡，可以長(zhǎng)時(shí)間逆轉(zhuǎn)乳腺癌小鼠回到正常狀態(tài)。Dontu等[24]懸浮培養(yǎng)正常乳腺干細(xì)胞微球發(fā)現(xiàn)，增加激活Notch 信號(hào)的DSL 信號(hào)肽，次級(jí)微球體增加10 倍，同時(shí)激活Notch 信號(hào)還可作用于多潛能祖細(xì)胞，促進(jìn)肌上皮細(xì)胞增生。而這一現(xiàn)象可以被Notch4封閉性抗體或者γ分泌酶抑制劑所阻斷。Harrison H等[25]分別用DAPT，Notch4基因沉默，Notch1基因沉默處理單層培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株MCF7，與普通培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞相比，使用DAPT培養(yǎng)的細(xì)胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細(xì)胞減少約30%，Notch4沉默培養(yǎng)的細(xì)胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細(xì)胞減少約50%，Notch1沉默培養(yǎng)的細(xì)胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細(xì)胞減少約15%。而且激活Notch信號(hào)會(huì)提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)輻射耐受[26]，在使用一定劑量射線(xiàn)輻射無(wú)粘連懸浮培養(yǎng)乳腺癌微球后，NICD表達(dá)明顯增加，乳腺癌干細(xì)胞比例也隨之增加。

以上研究表明，Notch信號(hào)分子對(duì)于促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖，維持癌干細(xì)胞表型有重要作用。Notch分子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的自我更新和增殖。沉默Notch基因或阻斷Notch信號(hào)通路，可誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞分化或凋亡，逆轉(zhuǎn)乳腺癌進(jìn)程。李傳偉等認(rèn)為[27]，當(dāng)乳腺干細(xì)胞經(jīng)歷多次致瘤性的打擊以后，Notch信號(hào)通路就可能被異常激活。同時(shí)參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化的功能隨之發(fā)生紊亂，細(xì)胞分化基因失活，而增殖基因激活，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。如果阻斷乳腺癌Notch信號(hào)通路，可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌進(jìn)程，會(huì)使乳腺癌細(xì)胞重新分化或凋亡。

3.2Notch1分子增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞遷徙活性

在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中惡性上皮細(xì)胞間黏附性降低，細(xì)胞獲得足夠的移動(dòng)能力從原發(fā)腫瘤解離，穿過(guò)細(xì)胞外間質(zhì)侵入血管，播散到遠(yuǎn)隔器官后侵出定植并導(dǎo)致繼發(fā)腫瘤。而上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起著重要作用[28]。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程[29]。包括細(xì)胞黏附分子(E-cadherin)表達(dá)減少；角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募?xì)胞骨架，并且引起細(xì)胞形態(tài)的改變。

Mani等[30]利用轉(zhuǎn)錄因子TWIST 、SNAIL及生長(zhǎng)因子TGF-β1誘導(dǎo)永生化乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，發(fā)現(xiàn)這些EMT細(xì)胞表達(dá)CD44+/CD24-/low，另外上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間葉組織標(biāo)志物N-cadherin、纖維蛋白和波形蛋白的表達(dá)上升。Morel等[31]通過(guò)激活RAS/MAPK信號(hào)通路也成功誘導(dǎo)永生化乳腺上皮產(chǎn)生CD44+/CD24-/low表型細(xì)胞。這些CD44+/CD24-/low細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的E-cadherin含量減少，N-cadherin、纖維蛋白和波形蛋白的表達(dá)上升，以及FoxC2、Snail、Twist和Slug的高表達(dá)，提示有遷徙活性的CD44+/CD24-/low表型細(xì)胞可能來(lái)自EMT轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

Zavadil J等[32]發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞EMT需要Notch信號(hào)通路的激活實(shí)現(xiàn)，如果沉默HEY1或JAG1基因，或者使用Notch抑制劑都可以阻斷EMT的發(fā)生。Stylianou小組[11]發(fā)現(xiàn)正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A持續(xù)表達(dá)RBP-Jκ/VP16 或 NICD導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，E-cadherin表達(dá)顯著減少。提示Notch信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷徙性的產(chǎn)生起著十分重要的作用。

在腫瘤組織中低氧刺激可以提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，并與腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)[33-34]，低氧可以激活Notch信號(hào)通路，使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、增加細(xì)胞侵襲力以改變這種低氧刺激。Timmerman等[35]發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號(hào)通路可以消除低氧引起的EMT和侵襲，相反激活Notch信號(hào)通路可以取代低氧直接引起EMT。

有研究報(bào)道，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞首先通過(guò)EMT而獲得遷徙活性，包括對(duì)周?chē)M織的浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，但是當(dāng)這些過(guò)程完成以后，細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)型重新獲得增殖能力[36]。

雖然激活Notch通路都可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷徙活性，但是臨床資料顯示，Notch1分子與乳腺癌的轉(zhuǎn)移的相關(guān)性更為密切。對(duì)于Notch1分子在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的確切機(jī)制，目前并不十分清楚，還需做大量更深入的研究。

綜上所述，Notch1通過(guò)促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干細(xì)胞遷徙活性，以此促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。然而，乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的十分復(fù)雜的過(guò)程，這些過(guò)程還要涉及癌細(xì)胞進(jìn)入血道或淋巴道、瘤細(xì)胞的歸巢和增殖、轉(zhuǎn)移組織器官的選擇等多個(gè)方面。由于沒(méi)有很好的研究手段，目前對(duì)于乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，僅停留在假說(shuō)階段，很多假說(shuō)還未得以證實(shí)。相信隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，研究方法和研究模型的改進(jìn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移的更深層次機(jī)制一定可以獲得澄清。在不久的將來(lái)乳腺癌轉(zhuǎn)移一定能夠得到有效控制，患者的生存時(shí)間、生活質(zhì)量從而得到大幅提升。

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