朱紅蕾，楊海龍

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

從廢棄畢赤酵母提取甘露聚糖的研究

朱紅蕾，楊海龍?

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

對廢棄畢赤酵母甘露聚糖的提取條件進行了研究.首先通過單因素試驗研究了NaOH濃度、時間、溫度和畢赤酵母濃度對甘露聚糖提取的影響，然后采用正交試驗分析法對影響甘露聚糖提取的這4個因素進行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明，畢赤酵母甘露聚糖提取的最佳工藝條件為：NaOH濃度5%，時間2.5 h，溫度80℃，畢赤酵母濃度12.5%.最佳工藝條件下，甘露聚糖的提取率約為4.4%.

畢赤酵母；甘露聚糖；提取工藝

甘露聚糖是免疫功能最強的酵母細胞壁多糖，它能增加動物體液免疫和細胞免疫能力，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，結(jié)合吸附外源性病原菌，選擇性吸附霉菌毒素，并具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤等活性功能[1-4]，是一種極具市場潛力的飼料添加劑和食品添加劑.

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一，目前許多產(chǎn)品，如植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等都在巴斯德畢赤酵母中獲得高效表達[5]，并實現(xiàn)了這些產(chǎn)品的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).利用工程菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)這些產(chǎn)品的同時會產(chǎn)生大量的菌體，約占發(fā)酵液體積的30% – 40%.以一個年生產(chǎn)4 000噸的植酸酶企業(yè)計，可產(chǎn)生廢酵母約500噸（以干物質(zhì)計），這些菌體如不加以處理直接排入環(huán)境，不僅會造成資源浪費，還會嚴重污染環(huán)境.因此，開展廢棄畢赤酵母綜合利用技術(shù)的研究并進行相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義.本文主要研究從廢棄畢赤酵母提取甘露聚糖的堿法提取工藝.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廢棄畢赤酵母泥：由溫州海螺挑戰(zhàn)生物工程有限公司提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 畢赤酵母甘露聚糖的提取

提取工藝如下：取廢畢赤酵母泥→按其干重配成一定濃度的懸浮液 50 mL（含一定濃度的NaOH）→在一定溫度下保溫提取一定時間→離心→棄去殘渣→上清液濃縮，加四倍量的乙醇→低溫過夜→離心取沉淀→測定多糖含量.

1.2.2 甘露聚糖含量的測定

苯酚-硫酸比色法[6].

1.2.3 畢赤酵母甘露聚糖提取條件優(yōu)化的試驗設(shè)計

影響畢赤酵母甘露聚糖提取的因素有很多，如NaOH溶液濃度，提取溫度、料液比、時間等.在甘露聚糖的提取過程中各個因素之間存在著相互作用，影響著甘露聚糖的提取.本研究利用正交試驗[7]分析研究NaOH濃度，提取溫度、料液比及時間對畢赤酵母甘露聚糖提取的影響.根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選出每個因素較好的三個水平做正交試驗，如表1.

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

甘露聚糖提取主要受NaOH濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、酵母濃度的影響，下面進行單因素試驗.

2.1 NaOH溶液濃度的選擇

取5 g畢赤干酵母（換算成濕酵母的質(zhì)量后進行稱量），提取條件先設(shè)定為90℃水浴、提取時間2 h、酵母濃度10%，NaOH的濃度梯度設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%、6%，通過苯酚－硫酸法測定吸光度值，最后按照公式換算成甘露聚糖含量，結(jié)果見圖1.

由圖1可見，隨著NaOH濃度的升高，甘露聚糖含量呈先上升后下降的趨勢，當堿濃度達到3%時，甘露聚糖含量達到最高，之后甘露聚糖的含量有所下降，所以，最佳NaOH濃度為3%.因此，可以選擇該堿濃度來做后面的實驗.

2.2 提取時間的選擇

取5 g畢赤干酵母（換算成濕酵母的質(zhì)量后進行稱量），用0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h的時間梯度進行提取，其它的提取條件設(shè)定為：NaOH濃度3%、90℃水浴、酵母濃度10%.結(jié)果見圖2.

由圖2可見，隨著反應(yīng)時間的增加，甘露聚糖的含量呈增加趨勢，反應(yīng)時間在0.5 h – 1.5 h之間，甘露聚糖含量增加比較緩慢，反應(yīng)時間超過1.5 h后，甘露聚糖的含量迅速增加，時間達到2 h后，甘露聚糖含量增加緩慢，2.5 h后，增加更為緩慢，考慮到如果提取時間過長，多糖會發(fā)生降解，雜質(zhì)也會相應(yīng)增多，所以，提取的最佳時間應(yīng)為2.5 h.

2.3 提取溫度的選擇

取5 g畢赤干酵母（換算成濕酵母的質(zhì)量后進行稱量），水浴提取的溫度設(shè)定為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，其它條件設(shè)定為：NaOH濃度3%、提取時間2 h、酵母濃度10%.結(jié)果見圖3.

由圖3可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，甘露聚糖含量呈上升的趨勢，這表明溫度越高越容易提取甘露聚糖.90℃前，溫度升高，甘露聚糖含量增加較快，90℃ – 100℃，甘露聚糖含量增加不明顯，所以，選擇90℃為最佳水浴提取溫度.

2.4 酵母濃度的選擇

稱取干畢赤酵母的質(zhì)量梯度為2.5 g、3.75 g、5 g、6.25 g、7.5 g（換算成濕酵母的質(zhì)量后進行稱量），即酵母的濃度梯度為5%、7.5%、10%、12.5%、15%，其它提取條件設(shè)定為：NaOH濃度3%，90℃水浴溫度，提取時間2.5 h.結(jié)果見圖4.

由圖4可見，隨著畢赤酵母濃度的增加，甘露聚糖的含量呈先上升后下降的趨勢，酵母濃度在5% – 12.5%之間，甘露聚糖含量增加，之后甘露聚糖含量下降.因此，當酵母濃度為12.5%時，甘露聚糖含量達到最大.

圖1 NaOH濃度對提取甘露聚糖的影響

圖2 時間對提取甘露聚糖的影響

圖3 溫度對提取甘露聚糖的影響

圖4 酵母濃度對提取甘露聚糖的影響

2.5提取條件的優(yōu)化

根據(jù)表1的正交試驗設(shè)計安排試驗，得到正交試驗表2.

表2 正交試驗方案設(shè)計及結(jié)果

由極差分析可知，以上因素對滸苔多糖提取率的影響程度從大到小依次為：NaOH濃度、酵母濃度、溫度、時間.根據(jù)以上分析，甘露聚糖提取的最優(yōu)條件組合為 A3B2C1D3，即提取的最適條件為：NaOH濃度5%、時間2.5 h、溫度80℃、酵母濃度12.5%.

2.6 優(yōu)化條件的驗證

在最佳工藝條件下進行5組實驗，得到的甘露聚糖含量分別為：43.08 mg·g-1、44.21 mg·g-1、42.70 mg·g-1、44.58 mg·g-1，43.46 mg·g-1，其平均值為43.61 mg·g-1，提取率約為4.4%.

3 小 結(jié)

本文研究了堿法提取畢赤酵母甘露聚糖的工藝條件，單因素試驗結(jié)果表明畢赤酵母甘露聚糖提取的最佳NaOH濃度為3%，時間為2.5 h，溫度為90℃，酵母濃度為12.5%.經(jīng)正交試驗分析，畢赤酵母甘露聚糖提取的最佳工藝條件為：NaOH濃度 5%、時間2.5 h、溫度80℃，酵母濃度12.5%.最佳工藝條件下，提取率約為4.4%.

從廢棄畢赤酵母泥中提取甘露聚糖，成本低廉，操作簡便，是廢畢赤酵母開發(fā)利用的一條好途徑.

[1]Pontón J, Omaetxebarría M J, Elguezabal N, et al. Immunoreactivity of the fungal cell wall [J]. Medical Mycology, 2001, 39(1): 101-110.

[2]Castro D P, Moraes C S, Garcia E S,et al. Inhibitory effects of D-mannose on trypanosomatid lysis induced bySerratia marcescens[J]. Experimental Parasitology, 2007, 115(2): 200-204.

[3]黃汝多, 李振華, 曹文廣, 等. 生物大分子功能的研究: 酵母甘露聚糖對8.2Gy60Coγ-射線輻照小鼠的輻射防護作用[J]. 激光生物學報, 1999, 8(3): 171-177.

[4]王義華, 徐梅珍, 江萍, 等. 酵母蛋白多糖的分離純化及鑒定[J]. 微生物學報, 2004, 44(4): 515-518.

[5]許英雷, 孫建義, 劉明啟. 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)及其在飼料添加劑開發(fā)上的應(yīng)用前景[J]. 飼料工業(yè), 2005, 26(2): 40-42.

[6]董群, 鄭麗伊, 方積年. 改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究[J]. 中國藥學雜志, 1996, 31(9): 550-553.

[7]裴洪平. 生物統(tǒng)計學[M]. 杭州: 浙江教育出版社, 1991: 233-250.

Study on Extraction of Mannan from WastedPichia pastoris

ZHU Honglei, YANG Hailong (School of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

In this paper, conditions of mannan extraction from wastedPichia pastoriswere studied. In the study, the effects of NaOH concentration, reaction time, reaction temperature andPichia pastorisconcentration on the extraction of mannan were studied by single-factor-test. Then the optimum conditions of extraction were further studied by orthogonal experimental design to these four factors. The results showed the optimum conditions of mannan extraction fromPichia pastorisare NaOH concentration of 5%, reaction time of 2.5 h, reaction temperature of 80℃ and yeast concentration of 12.5%; and under the optimum extraction process, the extracting ratio of mannan fromPichia pastorisis about 4.4%.

Pichia pastoris; Mannan; Extraction Process

(編輯：王一芳)

X79

A

1674-3563(2012)01-0017-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2012.01.004 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

2011-03-01

溫州市科技計劃項目(S20080025)

朱紅蕾(1987- )，女，浙江寧波人，學士，研究方向：生物技術(shù).? 通訊作者，yhl@wzu.edu.cn