陳 芳，馬鳳霞，池 穎，趙欽軍，楊少光，盧士紅，韓忠朝

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所＆血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

一種高效誘導(dǎo)胚胎胰腺細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立

陳 芳，馬鳳霞，池 穎，趙欽軍，楊少光，盧士紅，韓忠朝

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所＆血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

目的建立一種使胚胎胰腺細(xì)胞體外高效分化為成熟內(nèi)分泌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。方法體外分離小鼠12.5 d的胚胎胰腺，培養(yǎng)于下層為培養(yǎng)基的漂浮膜上7 d，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰腺祖細(xì)胞標(biāo)志胰腺十二指腸同源盒基因1(PDX-1)和神經(jīng)源素3(Ngn3)的表達(dá)及內(nèi)、外分泌細(xì)胞的標(biāo)志胰島素、胰高血糖素、羧肽酶表達(dá)，定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中胰腺標(biāo)志表達(dá)的變化。結(jié)果胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后，有大量胰腺祖細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)，且這些胰腺祖細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。培養(yǎng)3 d后，仍有胰腺祖細(xì)胞的標(biāo)志大量表達(dá)。培養(yǎng)7 d后，分化的胰腺表達(dá)成熟內(nèi)、外分泌細(xì)胞的標(biāo)志，且胰腺標(biāo)志的表達(dá)與體內(nèi)表達(dá)模式一致。結(jié)論建立了一種使胚胎胰腺細(xì)胞體外高效分化為成熟內(nèi)分泌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

胰腺;胰島素;腺十二指腸同源盒基因1;神經(jīng)源素3

中國(guó)糖尿病發(fā)病率已高達(dá)9.6%，其中以2型糖尿病為主，所占比例達(dá)到93.7%，1型糖尿病約占5%，其他類型糖尿病僅占0.7%，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后位居第三的嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病［1］。隨著胰島移植技術(shù)的發(fā)展，胰島移植成為治療胰島素依賴型糖尿病的一種有效方法。有研究顯示，胰島移植不僅能夠糾正糖代謝的紊亂，而且能夠防止或逆轉(zhuǎn)糖尿病的血管病變，為徹底治療糖尿病帶來(lái)希望［2-3］。但是，供體胰腺的不足限制了胰島移植的廣泛開(kāi)展，目前迫切需要尋找β細(xì)胞的新來(lái)源。最近，誘導(dǎo)全能的胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法取得了很大進(jìn)步，但是這種方法需要加大量的誘導(dǎo)因子，而且需要嚴(yán)格控制誘導(dǎo)因子的劑量和誘導(dǎo)時(shí)間，更重要的是難以產(chǎn)生成熟的、功能和體內(nèi)β細(xì)胞類似的胰島素分泌細(xì)胞［4-5］。因此，胰腺祖細(xì)胞成為最有應(yīng)用前景的β細(xì)胞新來(lái)源。成體胰腺是否存在胰腺祖細(xì)胞現(xiàn)還存在爭(zhēng)論［6-7］。胚胎胰腺富含大量的胰腺祖細(xì)胞，而且具有高增殖及低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)［8］。由于胰腺祖細(xì)胞缺乏特異的表面標(biāo)志，分離胰腺祖細(xì)胞有很大困難，并且由于胰腺祖細(xì)胞數(shù)量少，尚缺乏高效誘導(dǎo)胰腺祖細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。本研究建立了一種新的能在體外誘導(dǎo)胚胎胰腺細(xì)胞高效分化為內(nèi)分泌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

材料和方法

主要試劑 PRMI-1640培養(yǎng)基 (美國(guó) Gibco公司)，胎牛血清 (美國(guó)Hyclone公司)，牛血清白蛋白、抗胰島素抗體、抗胰高血糖素抗體、抗羧肽酶抗體、FITC標(biāo)記的抗兔IgG、Texas red標(biāo)記的抗小鼠IgG(美國(guó)Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (德國(guó)Qiagen公司)，LCR膜 (美國(guó)Millipore公司)，SYBR Green PCR master mix(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡成年雌性及雄性昆明小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌、雄性小鼠按2∶1的比例合籠，第2天早上雌、雄性分開(kāi)，檢查雌性小鼠的陰道拴來(lái)判斷是否懷孕，懷孕小鼠的胚胎計(jì)為0.5 d，12 d后取孕鼠的胚胎用來(lái)分離胚胎胰腺。

小鼠胚胎胰腺的分離 脫頸椎處死孕12.5 d的小鼠，酒精消毒后，打開(kāi)腹腔，剪開(kāi)子宮，把小鼠胚胎置于冰D-Hanks鹽溶液中，在體視顯微鏡下，首先切除胚胎的頭和四肢，再切除脊柱，然后切除肝臟以上部分。在紅色的肝臟下方可看到白色的胃和胰腺，切除肝臟，再仔細(xì)把胰腺和胃分開(kāi)。

胚胎胰腺的培養(yǎng) 取直徑為35 mm的培養(yǎng)皿或六孔培養(yǎng)板中加入2 ml PRMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1%非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺。LCR膜是一種親水性的聚四氟乙烯膜，把LCR膜平鋪于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，由于浮力作用LCR膜漂浮于培養(yǎng)基中。將分離好的孕12.5 d的胚胎胰腺組織(E12.5)置于LCR膜上，處于氣體和液體的分界面上 (圖1)，于飽和濕度、5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，培養(yǎng)7 d。

圖1 胚胎胰腺培養(yǎng)方法示意圖Fig 1 Illustration of culture method for embryonic pancreata

熒光免疫組織化學(xué)染色及定量 將胰腺組織固定于3.7%甲醛溶液中1 h，預(yù)包埋在4%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，然后包埋在石蠟中。包埋的胰腺組織切片后，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后，3%BSA阻斷非特異性結(jié)合，0.1%或0.3%triton透膜。加一抗于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入熒光標(biāo)記的抗一抗的二抗常溫避光孵育2 h，洗滌二抗后，Hoechst孵育10 min染細(xì)胞核，TBST洗滌3次后封片，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。為了定量胰島素、胰高血糖素等的表達(dá)，整個(gè)胰腺組織所有切片的1/3被拍照。用圖像分析軟件IP lab定量每張照片中胰腺標(biāo)志的染色，同樣定量Hoechst染色，兩者比值作為胰腺標(biāo)志的表達(dá)率。

總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用RNeasy微量試劑盒提取胰腺組織的總RNA，并用DNA酶處理以去除DNA污染。將50 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成的cDNA被稀釋10倍，取5 μl用于PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用7300系統(tǒng)，反應(yīng)體系包括SYBR Green熒光染料、反應(yīng)混合物、引物。將cyclophilin A作為內(nèi)對(duì)照，應(yīng)用相對(duì)定量的比較方法(2-ΔΔct)計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)水平。E15.5d胚胎胰腺的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

培養(yǎng)過(guò)程中胚胎胰腺形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化 分離的小鼠孕12.5 d胚胎胰腺由表皮和間充質(zhì)兩部分組成，胰腺間充質(zhì)位于外周包圍著胰腺表皮。當(dāng)胚胎胰腺培養(yǎng)于漂浮的膜上時(shí)，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。未經(jīng)培養(yǎng)的胚胎胰腺表皮和間充質(zhì)體積相似，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，間充質(zhì)體積逐漸縮小，表皮體積逐漸增大，胚胎胰腺的密度逐漸增加;培養(yǎng)7 d時(shí)，間充質(zhì)基本消失，胚胎胰腺的密度明顯高于未培養(yǎng)時(shí) (圖2)。

胰腺祖細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)的變化 胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后，有大量胰腺十二指腸同源盒基因1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)表達(dá)，PDX-1表達(dá)率為 (41±1)%;摻入BrdU的PDX-1陽(yáng)性細(xì)胞占總PDX-1陽(yáng)性細(xì)胞的 (29±2)%，多靠近間充質(zhì) (圖3)。培養(yǎng)3 d后，有大量神經(jīng)源素3(neurogenin 3，Ngn3)表達(dá)，Ngn3表達(dá)率為 (12±2)%(圖4)。培養(yǎng)7 d后，胚胎胰腺大量表達(dá)胰島素，胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的核表達(dá)PDX-1(圖5A);胰島素陽(yáng)性細(xì)胞和胰高血糖素陽(yáng)性細(xì)胞聚集在一起形成類似胰島的結(jié)構(gòu) (圖5B);胚胎胰腺表達(dá)外分泌細(xì)胞的標(biāo)志羧肽酶 (carboxypeptidase，CPA)，而且胰島素陽(yáng)性細(xì)胞和CPA陽(yáng)性的細(xì)胞完全沒(méi)有重疊 (圖5C);成熟的β細(xì)胞增殖率非常低，僅存在極少量胰島素BrdU雙陽(yáng)性細(xì)胞，與體內(nèi)胰腺類似 (圖5D);用不同濃度的葡萄糖刺激培養(yǎng)7d的胰腺，結(jié)果顯示高濃度葡萄糖能明顯刺激胰島素分泌 (圖5E)。

圖2 胚胎胰腺培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)變化 (×50)Fig 2 Morphological change of embryonic pancreata during culture(×50)

圖3 胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后PDX-1的表達(dá) (×200)Fig 3 Expression of PDX-1 in embryonic pancreata after cultured for 1 day(×200)

圖4 胚胎胰腺培養(yǎng)3 d后Ngn3的表達(dá) (×200)Fig 4 Expression of Ngn3 in embryonic pancreata after having been cultured for 3 days(×200)

圖5 胚胎胰腺培養(yǎng)7 d后內(nèi)、外分泌標(biāo)志的表達(dá)Fig 5 Expression of endocrine and exocrine markers in embryonic pancreata after having been cultured for 7 days

胚胎胰腺培養(yǎng)過(guò)程中胰腺特異性標(biāo)志表達(dá)的變化實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，胚胎胰腺培養(yǎng)過(guò)程中，PDX-1表達(dá)逐漸降低 (圖6A)，Ngn3表達(dá)逐漸增加，第3天時(shí)達(dá)最高。3 d后Ngn3表達(dá)逐漸下降 (圖6B)。剛分離的胚胎胰腺幾乎不表達(dá)胰島素，培養(yǎng)3 d后，胰島素僅有少量表達(dá)，培養(yǎng)7 d后，胰島素大量表達(dá) (圖6C)。β細(xì)胞的另一個(gè)標(biāo)志Znt8和胰島素的表達(dá)相一致 (圖6D)。胰腺外分泌的標(biāo)志淀粉酶的表達(dá)也和胰島素類似 (圖6F)。胰高血糖素的表達(dá)在剛分離的胚胎胰腺中表達(dá)較高，隨著胰腺祖細(xì)胞分化，胰高血糖素表達(dá)逐漸下降，第3天時(shí)表達(dá)最低，但隨著成熟α細(xì)胞出現(xiàn)，胰高血糖素表達(dá)逐漸增加 (圖6E)。

圖6 胚胎胰腺培養(yǎng)過(guò)程中胰腺標(biāo)志的表達(dá)Fig 6 Expression of pancreatic markers in embryonic pancreata during culture

討 論

為了誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞分化，目前大部分研究者采用單層培養(yǎng)或接種在matrigel上的三維培養(yǎng)，但誘導(dǎo)分化效率低，而且需要大量細(xì)胞因子［9-10］。本研究建立了一種新的培養(yǎng)方法，即使無(wú)任何誘導(dǎo)因子加入也能使胚胎胰腺細(xì)胞體外高效分化為內(nèi)分泌細(xì)胞，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單:直接培養(yǎng)胰腺組織，省略了把胰腺消化成細(xì)胞的步驟，維持了胰腺間充質(zhì)和表皮的相互作用。胰腺間充質(zhì)在胰腺發(fā)育過(guò)程中可發(fā)揮重要作用，不僅能促進(jìn)胰腺祖細(xì)胞增殖，維持胰腺祖細(xì)胞處于不分化狀態(tài)［11］，還可控制胰腺表皮的發(fā)育進(jìn)程［12］。本研究結(jié)果也顯示，隨著間充質(zhì)體積逐漸縮小，表皮體積逐漸增大，胰腺祖細(xì)胞逐漸分化。(2)有利于內(nèi)分泌細(xì)胞分化:本研究中分化胰腺的胰島素和胰高血糖素表達(dá)率分別為10.2%和5.4%，遠(yuǎn)高于體內(nèi)胰腺。(3)體外誘導(dǎo)胚胎胰腺分化過(guò)程與體內(nèi)相一致:培養(yǎng)過(guò)程中，胰腺祖細(xì)胞及內(nèi)、外分泌細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)與體內(nèi)一致。本研究中，體外培養(yǎng)的胰腺具有類似于活體胰腺的功能，外源性葡萄糖可以刺激其胰島素分泌增加，25 mmol/L葡萄糖刺激的胰島素釋放量是5 mmol/L葡萄糖的10倍左右。尤值一提的是，本研究所培養(yǎng)的胰腺組織取自小鼠胚胎12.5 d，此時(shí)胚胎胰腺組織含有大量祖細(xì)胞，相比較于晚期階段，這種早期階段的胰腺具有更低的免疫原性［8］。由于目前移植的最大障礙是免疫排斥的問(wèn)題，這種培養(yǎng)的低免疫原性早期階段的胰腺或許能夠改善移植排斥問(wèn)題。而且，胚胎胰腺體外培養(yǎng)7 d時(shí)，胰腺祖細(xì)胞已分化出內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞，可大大減少其移植應(yīng)用中的致瘤性問(wèn)題。體外培養(yǎng)胰腺組織中細(xì)胞的活性也與移植密切相關(guān)，在本組之前的研究中，大鼠胚胎胰腺體外培養(yǎng)14 d能夠保持很好的活性［13］。

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Establishment of a New Method to Induce the Differentiation of Embryonic Pancreatic Cells into Mature Endocrine Cells

CHEN Fang，MA Feng-xia，CHI Ying，ZHAO Qin-jun，YANG Shao-guang，LU Shi-hong，HAN Zhong-chao

State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases，CAMS and PUMC，Tianjin 300020，China

MA Feng-xia Tel:022-23909349，E-mail:mafengxia@gmail.com

ObjectiveTo establish a new culture method to induce the differentiation of embryonic pancreatic cells into mature endocrine cells.MethodsMouse embryos at day 12.5 were used and embryonic pancreata were isolated.The isolated embryonic pancreata were cultured on the filter for 7 days，which floated in the dish containing medium.During culture，the expression of pancreas duodenum homeobox-1(PDX-1)，a pancreatic stem cell marker，was examined at day 1.The expression of neurogenin 3(Ngn3)，a pancreatic progenitor cell marker，was examined at day 3.The expressions of endocrine and exocrine markers，insulin，glucagon，and carboxypeptidase(CPA)were examined at day 7 by immunohistochemistry.The kinetics of pancreatic marker expression during culture was assayed by real-time PCR.ResultsMany pancreatic stem cells still existed in embryonic pancreata cultured for 1 day;meanwhile，these pancreatic stem cells proliferated in high rate.A large amount of pancreatic progenitor cells were found in embryonic pancreata c ultured for 3 days.Pancreatic stem/progenitor cells differentiated into mature endocrine and exocrine cells in embryonic pancreata after having been cultured for 7 days.Furthermore，the expression pattern of pancreatic marker is consistent with thatin vivo.ConclusionWe successfully established a new culture method，with which embryonic pancreatic cells can efficiently differentiate into mature endocrine cell.

pancreas;insulin;pancreas duodenum homeobox-1;neurogenin 3

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):343-347

馬鳳霞 電話:022-23909349，電子郵件:mafengxia@gmail.com

R318.15

A

1000-503X(2012)04-0343-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.006

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃 (09JCYBJC09700)Supported by the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(09JCYBJC09700)

2011-11-27)

·綜 述·