劉迎九，文煜冰，陶建瓴，李金紅，蘇 穎，葉 葳，李 航，李雪梅，李學(xué)旺

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

糖尿病腎病腎組織足細(xì)胞損傷與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)及蛋白尿間的相關(guān)性

劉迎九，文煜冰，陶建瓴，李金紅，蘇 穎，葉 葳，李 航，李雪梅，李學(xué)旺

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

目的研究糖尿病腎病 (DN)患者腎組織足細(xì)胞損傷和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及尿蛋白量之間的關(guān)系。方法回顧性分析48例經(jīng)腎活檢確診為DN患者的臨床資料，根據(jù)尿蛋白量將患者分為＞3.5 g/d組 (n=31)和＜3.5 g/d組 (n=17)。對(duì)腎組織行威廉姆斯腫瘤蛋白-1(WT-1)免疫組織化學(xué)染色，冰凍腎組織行synaptopodin、GRP78免疫熒光雙染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。結(jié)果尿蛋白量＞3.5 g/d組的足細(xì)胞密度為0.10個(gè)/μm2，明顯低于尿蛋白量＜3.5 g/d組的0.15個(gè)/μm2(P=0.003)，足細(xì)胞密度與尿蛋白量呈負(fù)顯著相關(guān) (P=0.005)。腎小球Synaptopodin及GRP78表達(dá)呈線(xiàn)樣或顆粒狀沿基底膜排列，尿蛋白量與synaptopodin(P=0.004)和GRP78(P=0.001)表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論隨著尿蛋白量增加，DN患者的足細(xì)胞損傷程度隨之加重，伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力下降。

足細(xì)胞;糖尿病腎病;synaptopodin;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，以大量蛋白尿及彌漫腎小球硬化為主要表現(xiàn)。DN是引起終末期腎衰竭的重要原因［1］。有研究表明，在DN發(fā)病過(guò)程中，足細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且減少的程度與蛋白尿量呈正相關(guān)，足細(xì)胞數(shù)目越少，患者進(jìn)展至終末期腎衰竭的速度越快［2］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)［3］，細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)通過(guò)增加蛋白質(zhì)的降解和運(yùn)輸來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)有害刺激的抵抗能力。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶，其表達(dá)在一定程度上可反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)激調(diào)節(jié)的強(qiáng)度。有研究顯示，在微小病變腎病動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)GRP78表達(dá)升高，并且伴大量蛋白尿，初步證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與蛋白尿存在一定的關(guān)系，隨后在多種腎病患者腎組織中檢測(cè)到GRP78表達(dá)升高，但是在DN患者腎組織上還沒(méi)有進(jìn)行過(guò)此類(lèi)研究。synaptopodin是足細(xì)胞的特異性骨架蛋白，主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，威廉姆斯腫瘤蛋白-1(Wilms tumor-1，WT-1)是足細(xì)胞核蛋白，主要表達(dá)在細(xì)胞核，通過(guò)對(duì)這兩者的觀(guān)察可以間接了解足細(xì)胞的損傷情況。目前針對(duì)DN的研究主要集中在對(duì)DN早期發(fā)病機(jī)制的探索上，而有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種疾病致足細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用［4］。劉志紅等［5］以 WT-1標(biāo)記足細(xì)胞，在DN患者足細(xì)胞上觀(guān)察到隨著尿蛋白量增加WT-1表達(dá)減少，足細(xì)胞數(shù)量也隨之減少。但在DN患者中，并沒(méi)有研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在足細(xì)胞損傷中是否起到一定作用。本研究評(píng)估了DN患者不同尿蛋白量與足細(xì)胞損傷及GRP78表達(dá)之間的關(guān)系，初步探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與足細(xì)胞損傷及蛋白尿量的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

對(duì)象及分組 2001年1月至2011年1月在北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科住院、行超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮腎穿刺活檢病理診斷為DN的患者48例，其中，男24例，女24例，平均年齡 (45.4±11.2)歲;高血壓34例，貧血20例，血脂異常20例;腎小球彌漫硬化型22例，結(jié)節(jié)硬化型26例。排除各種原發(fā)性腎小球疾病、狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、腫瘤相關(guān)性腎病等其他繼發(fā)性腎小球腎炎。根據(jù)尿蛋白量不同，將患者分為尿蛋白量＞3.5 g/d(n=31)和尿蛋白量＜3.5 g/d(n=17)兩組。

臨床資料收集 收集患者的年齡、性別、糖尿病病程、空腹血糖、餐后血糖、糖化血紅蛋白、血脂、白蛋白、血肌酐、24 h尿蛋白等臨床資料。

免疫組織化學(xué)染色 腎組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成5 μm石蠟切片，脫蠟水化后，以3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，微波98℃熱處理25 min修復(fù)抗原，山羊血清封閉非特異性抗原，加入兔抗鼠WT-1(美國(guó)Santa Cruz公司，體積比1∶100)多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜標(biāo)記足細(xì)胞核。PBS沖洗，加入生物素化二抗 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替一抗做為陰性對(duì)照，棕褐色為陽(yáng)性著色。采用病理圖像分析軟件Image Pro-Plus(IPP)6.0半定量分析，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)腎小球［5］，計(jì)數(shù)WT-1染色陽(yáng)性的足細(xì)胞個(gè)數(shù)及染色陽(yáng)性面積/腎小球面積比。

免疫熒光染色 采用DN患者腎組織冰凍切片，厚度3 μm，滴加稀釋度1∶20(體積比)鼠抗人標(biāo)記的synaptopodin多克隆抗體 (美國(guó)Santa Cruz公司)，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，避光操作，滴加稀釋度1∶100(體積比)異硫氰酸熒光素 (FITC)綠色熒光(美國(guó)Santa Cruz公司)標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗，滴加1∶50(體積比)兔抗人標(biāo)記的GRP78多克隆抗體 (美國(guó)Santa Cruz公司)，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，滴加1∶100(體積比)羅丹明熒光素 (TRITC)紅色熒光 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育1 h，PBS沖洗，滴加10 μl抗熒光淬滅劑，封片，激光共聚焦顯微鏡 (Leica SP2)下觀(guān)察。

半定量分析 采用IPP多功能病理圖像分析軟件分析所有免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色切片，在單盲情況下逐一在顯微鏡下攝片，并將腎小球圖像采集入計(jì)算機(jī)，每例切片平均選取5個(gè)腎小球［6］，測(cè)定synaptopodin及GRP78陽(yáng)性表達(dá)面積，對(duì)不同尿蛋白量患者組間進(jìn)行比較，觀(guān)察其相關(guān)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，Pearson法分析相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組患者一般情況的比較 尿蛋白量＞3.5 g/d組和＜3.5 g/d組患者在男女性別比 (17/14比7/10，P=0.790)、年齡［(44.7±11.0)歲比(47.1±12.1)歲，P=0.594］、體重指數(shù) ［(26.04±3.79)kg/m2比(24.11±2.41)kg/m2，P=0.089］、糖尿病病程［(109.9±75.6)個(gè)月比 (112.9±70.0)個(gè)月，P=1.000］、空腹血糖 ［(8.34±2.67)mmol/L比(7.73±2.13)mmol/L，P=0.357］、餐后血糖［(12.09±3.41)mmol/L比 (13.05±4.02)mmol/L，P=0.450］，糖化血紅蛋白 ［(7.50±1.75)%比(7.71±1.32)%，P=0.379］、舒張壓 ［(90.28±15.66)mmHg比(84.81±11.51)mmHg，P=0.213，1 mmHg=0.133 kPa］、總膽固醇 ［(7.71±2.93)mmol/L比(5.39±1.37)mmol/L，P=0.006］、高密度脂蛋白膽固醇 ［(1.40±0.45)mmol/L比(1.27±0.48)mmol/L，P=0.699］、血尿素氮［(17.43±11.41)mmol/L比(20.92±11.79)mmol/L，P=0.850］和血清白蛋白［(26.38±5.47)g/L比 (34.23±8.06)g/L，P=0.077］等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尿蛋白量＞3.5 g/d組患者的收縮壓 ［(155.92±25.96)mmHg比(138.56±15.80)mmHg，P=0.047］、三酰甘油［(2.27±2.31)mmol/L比 (1.56±0.77)mmol/L，P=0.000］、低密度脂蛋白膽固醇 ［(5.08±1.90)mmol/L比 (3.64±1.00)mmol/L，P=0.017］、血肌酐 ［(136.31±56.72)μmol/L比 (115.81±32.67)μmol/L，P=0.028］和 24h尿 蛋白量［(9.18±5.02)g比 (2.21±0.89)g，P=0.000］均明顯高于＜3.5 g/d組患者。

腎小球足細(xì)胞密度與蛋白尿的關(guān)系 采用足細(xì)胞核蛋白WT-1對(duì)足細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行標(biāo)記 (圖1)，IPP圖像分析結(jié)果顯示，尿蛋白量＞3.5 g/d組的足細(xì)胞密度為0.10個(gè)/μm2，明顯低于尿蛋白量 ＜3.5 g/d組的0.15個(gè)/μm2(P=0.003)，且足細(xì)胞密度與蛋白尿量有明顯相關(guān)性 (P=0.005)(圖2)，其中尿蛋白量＞3.5 g/d組患者的足細(xì)胞密度減少程度比尿蛋白量＜3.5 g/d組的患者更明顯。

DN患者synaptopodin和GRP78的表達(dá)和分布情況 隨著蛋白尿量增加，synaptopodin和GRP78的表達(dá)逐漸下降，呈現(xiàn)分布不均、節(jié)段缺失，部分由線(xiàn)樣變?yōu)轭w粒狀，免疫熒光強(qiáng)度降低 (圖3)。IPP圖像半定量分析顯示，隨著尿蛋白量增加腎小球內(nèi)synaptopodin和GRP78表達(dá)逐漸降低。相關(guān)回歸分析結(jié)果顯示，DN患者的24 h尿蛋白量與synaptopodin和GRP78表達(dá)呈顯著相關(guān) (圖4)，但尿蛋白量＞3.5 g/d組和 ＜3.5 g/d組患者的 synaptopodin(57.67 μm2比 65.86 μm2，P=0.575) 和 GRP78(52.92 μm2比 62.58 μm2，P=0.220)的陽(yáng)性表達(dá)面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 足細(xì)胞威廉姆斯腫瘤蛋白-1免疫組織化學(xué)染色 (×200)Fig 1 Immunohistochemical staining of Wilms tumor 1(×200)

圖2 糖尿病腎病患者隨尿蛋白量增加足細(xì)胞密度下降Fig 2 Podocyte density decreases with the increase of urine protein in diabetic nephropathy patients

圖3 腎組織synaptopodin和GRP78表達(dá) (×1000)Fig 3 Expressions of synaptopodin and GRP78 in renal tissue(×1000)

圖4 糖尿病腎病患者隨尿蛋白量增加足細(xì)胞synaptopodin和GRP78表達(dá)下降Fig 4 The podocytes synaptopodin and the GRP78 expression decrease with the increase of urinary protein in diabetic nephropathy patients

討 論

腎小球足細(xì)胞受到損傷時(shí)生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生改變并發(fā)生脫落。synaptopodin是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其表達(dá)沿足細(xì)胞基底膜排列，具有調(diào)節(jié)足突形狀及運(yùn)動(dòng)和腎小球?yàn)V過(guò)的能力。WT-1是足細(xì)胞特異性核蛋白，其數(shù)量可以間接代表足細(xì)胞的數(shù)量。故本研究以synaptopodin作為足細(xì)胞骨架損傷的標(biāo)記，WT-1作為足細(xì)胞數(shù)量標(biāo)記，觀(guān)察DN患者足細(xì)胞損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組裝、折疊、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)的場(chǎng)所，能對(duì)脂質(zhì)及一些類(lèi)固醇進(jìn)行處理，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存庫(kù)［7］。當(dāng)機(jī)體處于低氧、低糖或有害刺激作用下時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積引發(fā)的。GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白，其增高間接表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的出現(xiàn)。靜息狀態(tài)下，GRP78錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的下游蛋白發(fā)生解離，下游蛋白進(jìn)一步作用于靶基因影響蛋白折疊和運(yùn)輸，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定［8］。Cybulsky等［9］研究發(fā)現(xiàn)在海曼腎炎中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)增高，此后進(jìn)一步證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了膜性腎病小鼠蛋白尿的產(chǎn)生，并證實(shí)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)行誘導(dǎo)可以減輕腎損傷［10］。Inagi等［11-12］在微小病變腎病動(dòng)物模型身上發(fā)現(xiàn)GRP78表達(dá)升高，并且伴大量蛋白尿，初步證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與蛋白尿存在一定關(guān)系。此后研究都表明，在微小病變 (minimal change nephropathy，MCD)、膜性腎病 (membranous nephropathy，MN)、局灶節(jié)段性腎小球硬化 (focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)腎病患者的腎臟中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78高表達(dá)，并且與蛋白尿量具有相關(guān)性，提示多種腎病患者都有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生［13］。Lindenmeyer等［14］采用葡萄糖刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮，6 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中GRP78基因表達(dá)上調(diào)，隨著腎損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78表達(dá)初期升高，隨著損傷加重GRP78表達(dá)下調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種腎損傷中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，隨著尿蛋白量的增加，DN患者腎組織足細(xì)胞的損傷逐漸加重，表現(xiàn)為足細(xì)胞數(shù)量減少和密度降低，說(shuō)明足細(xì)胞密度與蛋白尿量的多少具有相關(guān)性。此外，隨著足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的表達(dá)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78表達(dá)也減少，免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)，兩者隨著尿蛋白量增加而逐漸減少，分布也由沿腎小球基底膜線(xiàn)樣排列變成片狀或顆粒狀，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與足細(xì)胞損傷具有一定相關(guān)性。

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Correlations of Podocyte Injury with Glucose Regulated Protein 78 Expression and Proteinuria in Patients with Diabetic Nephropathy

LIU Ying-jiu，WEN Yu-bing，TAO Jian-ling，LI Jin-hong，SU Ying，YE Wei，LI Hang，LI Xue-mei，LI Xue-wang

Department of Nephrology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

TAO Jian-ling Tel:010-69155054，E-mail:tao_jianling@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the podocyte injury in patients with diabetic nephropathy(DN)and analyze its relationship with glucose regulated protein 78(GRP78)and proteinuria.MethodsThe clinical data of 48 patients diagnosed as DN by renal biopsy were reviewed.All patients were divided into two groups according to proteinuria(＞3.5 g/d，n=31 and ＜3.5 g/d，n=17).The density of podocytes was illustrated by immunohistochemistry staining of Wilms tumor-1(WT-1)，and the immunmoflourescence doublestaining results of synaptopodin and GRP78 in podocytes were also detected.ResultsThe podocyte density of urine protein＞3.5 g/d group was significantly lower than that of urine protein＞3.5 g/d group urine protein＜3.5 g/d group(P=0.003)，and it was negatively correlated with proteinuria(P=0.005).The expressionsof synaptopodin and GRP78 in podocytes were also negatively correlated with proteinuria(P=0.004 andP=0.001).ConclusionThe podocyte injury is aggravated with increased proteinuria in DN patients，along with the decrease of the adaptive ability of endoplasmic reticulum to stress.

podocyte;diabetic nephropathy;synaptopodin;glucose regulated protein 78

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):359-363

陶建瓴 電話(huà):010-69155054，電子郵件:tao_jianling@yahoo.com.cn

R587.2;R365

A

1000-503X(2012)04-0359-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.009

國(guó)家自然科學(xué)基金 (30700373、81170665)和2010年北京協(xié)和醫(yī)院青年基金Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30700373，81170665)and the Youth Fund of Peking Union Medical College Hospital

2011-09-25)

·論 著·