吳芬，陳蘇寧，蔣慧，王謙，潘金蘭，吳亞芳，丁家華，陳寶安，余正平，程堅(jiān)，王俊，趙剛

(1．東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009;2．東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液科，江蘇南京 210009;3．江蘇省血液病研究所，江蘇 蘇州 215006)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其特征為髓系細(xì)胞(粒系、紅系、巨核系)一系或多系發(fā)育異常和無效造血，外周血細(xì)胞一系或多系減少及急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)性［1］。DNA甲基化在MDS發(fā)病中起重要作用。近年來，去甲基藥物地西他濱已被證實(shí)對(duì)MDS患者有肯定療效，已成為一線治療藥物［1-4］。2008 年，Delhommeau 等［5］首次在髓系腫瘤中發(fā)現(xiàn)一種新的TET2基因。該基因是TET家族的一個(gè)成員，位于4q24，大小約150 kb，有11個(gè)外顯子，可能是一種抑癌基因，參與5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶之間的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)甲基化［6］。有報(bào)道稱其與惡性血液系統(tǒng)疾病有關(guān)［7-8］。目前多項(xiàng)研究［5，9］顯示，在髓系腫瘤中發(fā)現(xiàn)有 TET2 基因突變，以MDS多見，且突變發(fā)生于96%的骨髓原始細(xì)胞，提示其與該病的發(fā)生密切相關(guān)。MDS患者預(yù)后不良，約30%的轉(zhuǎn)化為AML，但多數(shù)死于骨髓衰竭引起的并發(fā)癥［10］。本研究通過檢測(cè)MDS患者中TET2基因突變的發(fā)生率來初步探討該基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 對(duì)象與方法

1． 1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2002年至2010年于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院血液科與蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科95例初診MDS患者。男56例，女39例，男女之比為1.44∶1;中位年齡為55歲(15～79歲)。根據(jù)2008年WHO分類和分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷與分型［11］，參照MDS標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行治療與療效評(píng)價(jià)［12］。

1． 2 方法

1．2．1 抽提基因組DNA及PCR 取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞5×106個(gè)或染色體懸液，PBS洗滌1次。選用Invitrogen公司(美國)提供的PureLinkTMGenomic DNA Kits試劑盒抽提基因組DNA，使用DNA測(cè)定儀檢測(cè)產(chǎn)物的濃度和純度后儲(chǔ)存于－20℃冰箱備用。PCR總體系為 25 μl:MIX(TIAN GEN)12．5 μl，基因組 DNA模板 1 μl，上游、下游引物各 1 μl，ddH2O 9.5 μl，反應(yīng)條件及引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓110 V，電流400 mA，時(shí)間40 min)，紫外光透視儀分析圖像并照相。PCR產(chǎn)物于4℃冰箱保存，1周內(nèi)測(cè)序。

表1 TET2基因引物序列

1．2．2 染色體核型分析 骨髓細(xì)胞經(jīng)過24 h短期培養(yǎng)后，按常規(guī)制備染色體懸液，熱變性R顯帶，平均每例分析20個(gè)中期分裂相，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名制(ISCN2005)》進(jìn)行核型描述。

1．2．3 基因突變檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海裕晶生物科技公司完成測(cè)序，結(jié)果與NCBI人類TET2基因序列進(jìn)行比對(duì)，檢出突變。

1． 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17．0。定量資料采用秩合檢驗(yàn)或精確t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以ˉx±s或中位數(shù)表示;定性資料采用χ2檢驗(yàn)，生存情況描述運(yùn)用Kaplan-Meier曲線，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2． 1 臨床特征

據(jù)2008年WHO分類和分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)95例初診MDS患者進(jìn)行診斷和分型，MDS-RCUD 18例，占18.9%，RA 7例，RT 1例，RN 1例;MDS-RARS 3例，占3.1%;MDS-RCMD 21例，占22.1%;MDS-RAEB1 15例，占15.8%;MDS-RAEB2 19例，占20.0%;MDSU 19例，占20.0%。中位白細(xì)胞數(shù)值為2.9×109L－1［(0.8～34.4)×109L－1］，中位中性粒細(xì)胞數(shù)值為1.22×109L－1［(0 ～10.54)×109L－1］;中位血小板數(shù)值為72×109L－1［(10 ～615)×109L－1］;中位血紅蛋白值為 74 g·L－1(30 ～142 g·L－1);外周血 3 系正常2例，單系減少19例，2系減少40例，3系減少34例;IPSS危險(xiǎn)分級(jí)為:低危組6例，中危1組65例，中危2組18例，高危組6例。

2． 2 TET2 突變檢測(cè)

95例初診MDS患者中有11例發(fā)生TET2基因突變，突變率為11.6%(95%CI為5.2% ～18.0%)，包括點(diǎn)突變、插入突變和缺失突變，其中6例發(fā)生錯(cuò)義突變，1例出現(xiàn)2次錯(cuò)義突變，2例同義突變，2例無義突變;5例突變出現(xiàn)于3號(hào)外顯子，2例于6號(hào)外顯子，1例于7號(hào)外顯子，3例于11號(hào)外顯子。TET2基因突變集中于3號(hào)外顯子并且以錯(cuò)義突變多見。該11例TET2基因突變患者的臨床特征及突變相關(guān)信息見表2與圖1。

2． 3 TET2基因突變臨床意義

對(duì)95例初診MDS患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期至2011年06月30日，隨訪有效率為63.2%。60例患者中位隨訪時(shí)間為13個(gè)月(2～73個(gè)月)，隨訪中死亡的患者均死于MDS。發(fā)生TET2基因突變的初診MDS患者有11例，中位生存期9個(gè)月(5～28個(gè)月);未發(fā)生該基因突變者有51例，中位生存期為15個(gè)月(3～73個(gè)月)。將隨訪到的60例初診MDS患者分為兩組(突變組與野生組)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示兩組患者在性別、年齡、血紅蛋白計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及骨髓原始細(xì)胞所占比例上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);再根據(jù)IPSS國際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)，兩組患者在外周血血象減少種類和細(xì)胞遺傳學(xué)方面亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。數(shù)據(jù)分析顯示，突變組MDS患者6年累積存活率為11.1%(1/9)，野生組患者6年累積存活率為55.74%(34/61)，兩組患者總生存率有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，伴有TET2基因突變的MDS患者中位生存期較未發(fā)生突變者短(9個(gè)月vs 15個(gè)月，P=0.000)(見圖2)，兩組MDS患者的一般臨床資料見表3。

表2 TET2基因突變的11例MDS患者的臨床特征與突變相關(guān)信息

圖1 TET2基因突變類型

表3 TET2基因突變組與野生組MDS患者一般臨床資料

圖2 TET2基因突變與未突變的MDS患者生存曲線

3 討 論

在髓系腫瘤中，MDS是一組源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。形態(tài)學(xué)(外周血和骨髓)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及IPSS預(yù)后積分系統(tǒng)，是MDS診斷分型與預(yù)后評(píng)價(jià)的主要方法和標(biāo)準(zhǔn)。染色體核型分析與熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)作為細(xì)胞遺傳學(xué)分析的重要手段［10，13］，約50%的 MDS患者可檢測(cè)到細(xì)胞遺傳學(xué)異常［10］。根據(jù)IPSS預(yù)后評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，僅幾種再現(xiàn)性染色體異常，如－5/5q－、－7/7q－、20q－、－Y等與MDS的預(yù)后有關(guān)。近年來，在髓系腫瘤中發(fā)現(xiàn)多種基因突變?nèi)?TET2、RUNX1、CBL 等［6，14］，可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5，7，14］，這些微小分子異常采用常規(guī)檢測(cè)方法較難發(fā)現(xiàn)。2009年，Langemeijer等［9］在MDS患者中通過基因芯片和基因測(cè)序法檢測(cè)出TET2基因突變(26%)，且96%骨髓原始細(xì)胞包括CD34+祖細(xì)胞在內(nèi)的各系分化細(xì)胞中均有該基因突變，提示其與MDS發(fā)病有關(guān)。此外，突變也見于骨髓增殖性腫瘤(MPN)、慢性粒單核細(xì)胞白血病(CMML)和AML，表明該基因可能是髓系腫瘤高度相關(guān)的新型分子［5，15］。

本研究采用基因直接測(cè)序法檢測(cè)國內(nèi)初診MDS患者TET2基因的突變率。結(jié)果顯示，95例初診MDS患者中TET2基因突變率為11.6%，包括錯(cuò)義突變、同義突變和無義突變，且突變多集中于3號(hào)外顯子。TET2在MDS中是迄今為止發(fā)現(xiàn)最常見的突變基因，可能與細(xì)胞的惡性克隆有關(guān)［16］。該基因突變發(fā)生在MDS早期，可出現(xiàn)多次突變，其mRNA在所有粒系細(xì)胞中均低表達(dá)，表明該基因可抑制細(xì)胞增殖［9］。由于所有MDS患者均存在成熟粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的缺陷，TET2基因表達(dá)下降可能是由MDS中粒細(xì)胞異常分化引起的，這些現(xiàn)象提示該基因與髓系細(xì)胞分化有關(guān)。TET2基因的功能尚不清楚，但有文章指出其同源TET1基因能夠?qū)?-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，參與甲基化調(diào)控，TET2基因也具有相同的酶活性，其突變后可增強(qiáng)DNA甲基化，促進(jìn)細(xì)胞惡性克隆增殖［5，16-17］。

目前，分子水平上TET2基因突變對(duì)MDS患者預(yù)后影響尚不明確［18］。本研究隨訪了60例初診MDS病例，發(fā)現(xiàn)9例TET2基因突變，男性多于女性，至隨訪截止時(shí)間僅有1例存活且依賴成分輸血。本組從性別、年齡、血液學(xué)(血紅蛋白、白細(xì)胞及血小板)、骨髓原始細(xì)胞比例、外周血細(xì)胞減少種類及核型異常檢出率上進(jìn)行分析，兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與國外文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論［19］相同。盡管本研究中TET2基因突變組與野生組在性別與年齡上無差異，但亦有文獻(xiàn)［20］報(bào)道MDS患者預(yù)后與年齡、性別、是否依賴輸血有關(guān)，年齡越大，預(yù)后越差，男性比女性患者預(yù)后差，依賴輸血者的生存期短于不依賴輸血者。此外，通過分析發(fā)現(xiàn)，伴有TET2基因突變患者的中位生存期僅有9個(gè)月，且生存率僅有11.1%，較未發(fā)生該基因突變者顯著減低。本組TET2基因突變的MDS患者中位生存期與生存率均低于國外相關(guān)研究報(bào)道［5，9］。分析可能原因?yàn)?(1)MDS病例少，且隨訪困難;(2)MDS患者多為65～75歲老年人，其中部分需要依賴成分輸血［20-21］;(3)MDS病情復(fù)雜，衍變迅速，患者的醫(yī)從性差。

綜上所述，骨髓增生異常綜合征是一組克隆性造血干細(xì)胞疾病，其發(fā)生與進(jìn)展是一個(gè)極其復(fù)雜的多階段過程，導(dǎo)致臨床患者有很強(qiáng)的異質(zhì)性。TET2基因突變是一種新型分子學(xué)異常，參與MDS異常甲基化和髓系細(xì)胞的異常分化，其突變對(duì)疾病預(yù)后評(píng)價(jià)有重要的臨床指導(dǎo)意義，去甲基化藥物對(duì)于MDS中TET2基因突變患者的治療意義尚待明確。

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