黃富英，李艷彩，馮樹清，王 飛，李元軍

(漳州師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，福建 漳州 363000)

研究蛋白質(zhì)(酶)的直接電化學(xué)和電催化，對于認(rèn)識生命體內(nèi)的電子傳遞機(jī)理和酶的催化機(jī)理以及重要生命物質(zhì)在生命體內(nèi)的代謝過程具有重要意義[1].納米材料由于具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能近年來備受關(guān)注，常用的納米材料有金屬納米材料[2-3]、金屬氧化物納米材料[4-5]、碳納米管[6]和半導(dǎo)體材料[7-8]等.隨著納米材料研究的深入，蛋白質(zhì)分子在納米材料上固定的研究受到廣泛關(guān)注[9-11].肌紅蛋白(Mb)參與的涉及電子傳遞的代謝過程及生理功能，是研究血紅素類蛋白質(zhì)(酶)的直接電化學(xué)、電催化和生物傳感的理想模型.

碳納米管(CNT) 獨(dú)特的結(jié)構(gòu)能大大促進(jìn)蛋白質(zhì)(酶)的直接電子轉(zhuǎn)移和有效的保持其生物活性.近年來，已有不少文獻(xiàn)報道將碳納米管修飾到電極表面，用于化學(xué)以及生物傳感器的構(gòu)建[12-13].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有很高的電子傳遞效率及良好的生物相容性等特性，這些特性使其成為電化學(xué)傳感領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)[14-15].近來，將碳納米管和某些活性材料如聚合體，氧金屬納米粒子、化還原電子媒介等進(jìn)行復(fù)合的研究也引起了研究者的廣泛關(guān)注[16-17].然而，碳納米管具有很強(qiáng)的范德華力，一般很容易集結(jié)成束，從而不易溶解，限制了其在電化學(xué)中的應(yīng)用.殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，是甲殼素(chitin) 的脫乙?；a(chǎn)物[18]，是一種線型聚合物，在其重復(fù)的單元上具有羥基、氨基.殼聚糖具有良好生物相容性，分子中的氨基(-NH2)能通過離子吸附的形式有效地應(yīng)用于固定蛋白質(zhì)(酶)，從而成為生物傳感器的理想成膜材料.而且，由于殼聚糖(chit)在特定的條件下，能發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)，成膜后具有很好的穩(wěn)定性、吸附性和生物相容性，加上其含有活潑的氨基和羧基使它被廣泛運(yùn)用于修飾電極的制備和生物分子的固定.因此，本文將多壁碳納米管(MWCNTs)溶解在殼聚糖溶液中，得到具有良好粘性和成膜性的多壁碳納米管-殼聚糖(MWCNTs-Chit)溶液.

本文探討了AuNRs促進(jìn)Mb在MWCNTs-Chit 復(fù)合物膜電極上的直接電子轉(zhuǎn)移和電催化行為.通過滴涂法將AuNRs、Mb 和MWCNTs-Chit混合分散液依次修飾到玻碳電極表面，用循環(huán)伏安法表征修飾電極，得到了相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù).Chit在其中起到成膜的作用，MWCNTs充當(dāng)電子轉(zhuǎn)移的通道，AuNRs起到了電子導(dǎo)線的作用.修飾電極實(shí)現(xiàn)了Mb 的直接電化學(xué)并對H2O2的還原具有良好的電催化效應(yīng)，可用作檢測H2O2的電化學(xué)生物傳感器.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

馬心肌紅蛋白(美國Sigma公司)；AgNO3，HAuCl4·3H2O，NaBH4，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多壁碳納米管(MWCNTs，純度超過95 %)購自深圳納米港；H2O2(30wt. %)購于汕頭西隴化學(xué)試劑有限公司.殼聚糖(chit)購于廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；0.025 g殼聚糖溶解于5 mL 1%的乙酸溶液中得到殼聚糖溶液(0.5 wt.%).其他所用到的化學(xué)試劑均為分析純試劑；所用溶液均用二次蒸餾水來配制.

1.2 儀器及分析方法

紫外可見光譜儀(GBC Cintra 10e)；電化學(xué)工作站(CHI 650C，上海辰華)；電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(3 mm直徑)，參比電極為Ag/AgCl電極(3.0 mol/LKCl)，輔助電極為鉑絲電極.在電化學(xué)實(shí)驗(yàn)前對溶液進(jìn)行通氮?dú)獬?

1.3 金納米棒的制備

參照文獻(xiàn)[19]，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為模板的銀離子輔助種子生長法來合成金納米棒.合成過程如下，將100 μL 0.02 M HAuCl4加入到1.5 mL 0.1 mol/L CTAB溶液中并不斷攪拌.再加入100 μL 0.01 M的NaBH4溶液，最后混合溶液變?yōu)樽攸S色.將溶液劇烈攪拌2 min后，保存于25℃水浴中.合成后將種子液放置2 h再使用.金納米棒生長液的合成方法為：將1.5 mL 0.02 M HAuCl4溶液和1.0 mL 0.01 M AgNO3溶液分別加入到30 mL 0.1 M的CTAB溶液中，然后再加入0.8 mL 0.08 M的抗壞血酸溶液.兩種溶液都制備好以后，在生長液中加入70 μL種子液，溫度為25℃.在開始的15 min內(nèi)，溶液的顏色會漸漸變化最后穩(wěn)定.

1.4 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極的制備

試驗(yàn)中所用到的玻碳電極依次用1.0 μm，0.3 μm和0.05 μm的Al2O3進(jìn)行拋光，并分別使用乙醇和蒸餾水超聲清洗3次，用循環(huán)伏安法檢測電極的可逆性，最后用氮?dú)獯蹈?首先將10 μL的AuNRs溶液滴加到處理干凈的電極上，自然晾干.然后再滴加10 μL 3.0 mg/mL的Mb溶液(pH=6.5磷酸緩沖溶液)到電極表面，在冰箱內(nèi)放置12 h，最后滴加0.5%(w/v)的MWCNTs-Chit復(fù)合物到電極表面，置于冰箱5 h后，得到MWCNTs-Chit/Mb/ AuNRs復(fù)合膜電極.

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNRs的表征

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為模板的銀離子輔助種子生長法合成的AuNRs的透射電鏡圖如圖1A所示.

圖1 AuNRs的TEM圖(A)和AuNRs的紫外-可見吸收光譜圖(B)

圖2 0.1M pH=7.0的磷酸緩沖溶液中(a)裸玻碳電極(b)MWCNTs-Chit/Mb/GCE (c) AuNRs/Mb/GCE (d)MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE循環(huán)伏安圖，掃速為100 mV·s-1

圖3 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE在不同掃速下在0.1 mol·L-1 pH=7.0磷酸緩沖溶液中循環(huán)伏安曲線(由內(nèi)→外：10,25,50,75,100,150,200,250,300,350,400,450,500 mV·s-1)

圖4 陰極峰電流、陽極峰電流與掃速的關(guān)系曲線

從電鏡圖中可以看到AuNRs的形貌為棒狀，棒長為40～50 nm，棒寬為15～20 nm.圖1B為AuNRs的紫外-可見吸收光譜.從紫外圖中可以看出在520 nm與660 nm各有一處吸收峰，其分別是AuNRs的寬度與長度的表面等離子體共振波長.

2.2 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極的直接電化學(xué)

圖2是不同電極在0.1 M pH=7.0的磷酸緩沖溶液中測得的循環(huán)伏安圖.由圖2a可以看出，在裸玻碳電極上除了具有較小的背景電流外，沒有出現(xiàn)氧化還原峰.而AuNRs/Mb/GCE(圖2c)表現(xiàn)出一對可逆的氧化還原峰，但是電流響應(yīng)遠(yuǎn)小于MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs修飾的電極(圖2d)，說明在AuNRs和MWCNTs-Chit的復(fù)合膜電極上實(shí)現(xiàn)了Mb的直接電子轉(zhuǎn)移.在MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE(圖2d)上可以觀察到一對可逆的氧化還原峰，陰極峰電位(Ep,c)和陽極峰電位(Ep,a)分別為-0.291和-0.235 V，式電位[Eθ’=(Ep,c+Ep,a)/2]為-0.263 V，電流響應(yīng)信號來自膜內(nèi)Mb的電活性中心血紅素的氧化還原[MbFe(Ⅲ)/MbFe(Ⅱ)]，這表明Mb與電極之間較好的實(shí)現(xiàn)了直接電子轉(zhuǎn)移，并保持了其自身的生物活性.另外，AuNRs/Mb/GCE(2c)修飾的電極電流響應(yīng)大于MWCNTs-Chit/Mb/GCE(2b)修飾的電極，這主要源于AuNRs具有較好的生物相容性和導(dǎo)電性能夠有效地促進(jìn)蛋白與電極表面間電子轉(zhuǎn)移.

圖3是在pH為7.0磷酸緩沖溶液中MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖.從圖中可以看出在掃速在10～500 mV/s范圍內(nèi)循環(huán)伏安曲線基本上是對稱的，氧化峰電流與還原峰電流隨掃速的增大而增大，而電位變化很小.由圖4可知，氧化峰電流、還原峰電流分別與掃速呈線性關(guān)系：

Ipc=-0.115 6+0.030 7 v(V·s-1), R=0.999 2; Ipa=-0.636 5-0.043 3 v(V·s-1), R=0.998 5)，

這說明固定在MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極中的Mb是典型的表面控制電化學(xué)過程[20].峰電位在10～500 mV·s-1范圍內(nèi)隨著掃速的改變而發(fā)生改變，還原峰電位隨著掃速的增加而負(fù)移，氧化峰電位隨著掃速的增加而正移，然而式電位沒有改變，這說明電極上進(jìn)行的反應(yīng)主要受吸附控制.

2.3 pH值對電極電位的影響

在多數(shù)情況下，蛋白的電化學(xué)行為受溶液的pH值影響很大.一般情況下，溶液的pH值決定了氧化還原的式電位，這表明了在蛋白的氧化還原過程中質(zhì)子參與了反應(yīng).圖5給出了MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極在不同的pH值緩沖溶液中且掃速為100 mV·s-1下測得的循環(huán)伏安圖.通過實(shí)驗(yàn)得到一對峰形良好并且穩(wěn)定的氧化還原峰，緩沖溶液pH值的增大會導(dǎo)致Mb的氧化還原峰的峰電位向負(fù)移，這充分說明了在Mb的電極反應(yīng)過程中有質(zhì)子參與[21].圖6給出了[Mb Fe(Ⅲ)]/[Mb Fe(Ⅱ)]電對的式電位(Eθ′)與pH值之間的關(guān)系.從圖中可以看出，在pH從5到11之間，[Mb Fe(Ⅲ)]/[Mb Fe(Ⅱ)]電對的式電位與pH呈線性關(guān)系，計(jì)算得斜率為-51.05 mV/pH，這一數(shù)值比理論值58 mV/pH小得多， 一方面可能是由于亞鐵血紅素中的鐵和亞鐵血紅素周圍氨基酸反式配體的質(zhì)子化作用的影響，另一方面也可能是由于中心鐵受到水分子質(zhì)子化的影響.因此，在電子傳遞反應(yīng)過程中，電極與Mb之間可以用下式簡單表示：

Mb heme Fe(Ⅲ)+H++e-?Mb heme Fe(Ⅱ)

圖5 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE在不同pH值(5, 7, 9, 11)磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線 圖6 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE中[Mb Fe(Ⅲ)]/[Mb Fe(Ⅱ)]電對的式電位與pH的關(guān)系曲線

圖7 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE在含H2O2濃度分別為：(a)0 mM；(b)3 mM；(c)6 mM；(d)9 mM；(e)12 mM；(f)15 mM；(g)20 mM的pH=7.0磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏曲線，掃速為50 mV·s-1 內(nèi)插圖：催化峰電流與H2O2濃度關(guān)系曲線

2.4 MWCNTs-Chit/Mb/ AuNRs復(fù)合膜電極對H2O2的電催化還原

通過循環(huán)伏安法來研究MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極對H2O2的電催化性能.圖7給出了在-0.23 V附近隨著H2O2濃度的逐漸增大(a→g)還原峰電流迅速增大，與此同時伴隨著氧化峰電流的逐漸變小.這表明Mb對H2O2進(jìn)行的催化反應(yīng)過程是一個典型的電催化還原反應(yīng)過程.該反應(yīng)的原因是肌紅蛋白中的[Mb/Fe(Ⅱ)]具有還原性，能將H2O2還原而自身被氧化成[Mb/Fe(Ⅲ)]，最后又重新被還原回[Mb/Fe(Ⅱ)]，這一反應(yīng)過程體現(xiàn)了Mb與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移.其中內(nèi)插圖給出了MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs修飾電極上Mb峰電流與H2O2濃度之間的線性關(guān)系曲線.

2.5 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs/GCE對H2O2的電流-時間響應(yīng)

圖8是工作電位為-0.25 V時，傳感器在0.1M(pH=7.0)磷酸緩沖溶液中測得的電流-時間響應(yīng)曲線.傳感器對加入的H2O2表現(xiàn)出快速而靈敏的響應(yīng).當(dāng)加入少量的H2O2(20μL)到底液中時，還原電流迅速增大直至穩(wěn)定.由圖8可以看出，隨著加入H2O2濃度的增加，響應(yīng)電流逐漸增大.圖8中內(nèi)插圖給出了穩(wěn)態(tài)電流與H2O2濃度的關(guān)系曲線，在濃度范圍在5.0×10-5到5.0×10-3M之間，電流與H2O2濃度存在較好的線性關(guān)系.其中線性回歸方程為：I(μA)=4.648+9.041×10-6C(μM)，相關(guān)系數(shù)為0.986 7(n=10).由曲線的斜率可知，當(dāng)信噪比為3時，其檢測限為3.2×10-6M.傳感器的快速響應(yīng)可歸因于AuNRs與MWCNTs之間的協(xié)同作用，具有較大比表面的AuNRs和MWCNTs都可以有效地促進(jìn)Mb與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.此外，傳感器的電流在不到5 s時間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，表明這是一個較快的反應(yīng)過程.

圖8 向5 mL 0.1 M的磷酸緩沖溶液中依次加入20 μL 10 mM的H2O2 時的電流-時間曲線，工作電位為-0.25 V；內(nèi)插圖：電流與H2O2濃度關(guān)系曲線

2.6 MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性

為了觀察電極的重現(xiàn)性，制備6根相同的電極來檢測電極對10 mM H2O2的電流響應(yīng).最后得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%.為了研究電極的穩(wěn)定性，將制備的電極保存在冰箱中來檢測電流的大小變化.當(dāng)將修飾電極在4℃下保存7 d后，沒有表現(xiàn)出明顯的電流減?。欢４?0 d以后仍然保持原有的電流響應(yīng)的90%.傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性說明了Chit與AuNRs具有良好的生物相容性以及適于固載蛋白質(zhì)在電極上，由此可見，AuNRs比較溫和，導(dǎo)電性好，能很好的固載Mb實(shí)現(xiàn)其電子轉(zhuǎn)移，并且保持其生物活性.

3 小結(jié)

通過用MWCNTs-Chit/Mb/AuNRs復(fù)合膜將Mb固載到玻碳電極上來制備傳感器.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明修飾電極上涉及到的[Mb-Fe(III)/Fe(II)]氧化還原電對之間的電子轉(zhuǎn)移速率與裸電極上的Mb的電子轉(zhuǎn)移速率相比要快得多.說明MWCNTs與AuNRs具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，為Mb提供了一種類似于本體的微環(huán)境，有利于Mb的直接電子轉(zhuǎn)移.此外，該傳感器對H2O2具有較好的電催化還原作用，所以該復(fù)合膜為基于酶的直接電化學(xué)制備第三代生物傳感器方面提供了一種新思路.

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