劉飛，焦月華，郭文奎，于微，谷春濤，高學(xué)軍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程博士后流動(dòng)站，哈爾濱 150030；2.丹尼斯克（中國(guó)）有限公司博士后科研工作站，昆山 江蘇 215300；3.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

弱后酸化保加利亞乳桿菌突變菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

劉飛1,2，焦月華3，郭文奎1，于微1，谷春濤1，高學(xué)軍1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程博士后流動(dòng)站，哈爾濱 150030；2.丹尼斯克（中國(guó)）有限公司博士后科研工作站，昆山 江蘇 215300；3.黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

對(duì)從傳統(tǒng)乳制品中篩選得到的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發(fā)突變株KLDS 1.9201-4的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究。將突變菌株進(jìn)行連續(xù)傳代，觀察形態(tài)學(xué)變化，利用HPLC分析葡萄糖和乳酸的代謝情況，RAPD分析基因組DNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，突變菌株KLDS 1.9201-4能夠穩(wěn)定遺傳至第8代，在傳代過(guò)程中菌落和菌體特征沒(méi)有發(fā)生明顯變化，KLDS 1.9201-4對(duì)初始葡萄糖的代謝率逐漸升高，終產(chǎn)物中乳酸的濃度也逐漸升高。KLDS 1.9201-4的基因組DNA相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有發(fā)生明顯變異。弱后酸化德氏乳桿菌保加利亞亞種的自發(fā)突變株KLDS 1.9201-4具有適宜的遺傳穩(wěn)定性，可被用于制作弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑。

德氏乳桿菌保加利亞亞種；遺傳穩(wěn)定性；突變株；后酸化

0 引 言

酸奶作為一種具有益生作用的乳制品，已經(jīng)普遍被消費(fèi)者認(rèn)可，但是由于酸奶正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸、銷售等過(guò)程會(huì)發(fā)生后酸化，使感官質(zhì)量下降，影響酸奶的保質(zhì)期[1]。德氏乳桿菌保加利亞亞種是導(dǎo)致酸奶發(fā)生后酸化的主要原因，它具有較強(qiáng)的耐酸性，當(dāng)外界環(huán)境中pH值降低時(shí)，其質(zhì)膜H+-ATPase能將細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子泵出胞外，形成跨膜pH梯度差，使胞內(nèi)代謝酶活力不受影響。當(dāng)環(huán)境中pH值達(dá)到3.5時(shí)，跨膜pH梯度差才不存在，新陳代謝活動(dòng)受到抑制[2-3]，然而，理想酸奶產(chǎn)品的pH值在4.2左右。因此，針對(duì)酸奶“后酸化”這一問(wèn)題，本研究對(duì)通過(guò)誘變育種得到的H+-ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究[3]，為最終開(kāi)發(fā)弱后酸化酸奶發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

①德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）KLDS 1.9201-4為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。②培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基[4]，脫脂乳培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑和儀器

葡萄糖和乳酸標(biāo)樣，rTaq和dNTP，其余試劑均為分析純。低溫冷凍離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀9700，光學(xué)顯微鏡，紫外分光光度計(jì)DU-800，HPLC Waters 2695等。

1.2 菌株的傳代培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的KLDS 1.9201-4接入到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)，每24 h傳代一次，均按照3%接種量接種。

1.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，每次傳代之前都觀察菌株在液體培養(yǎng)基中的菌液狀態(tài)，并利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 菌株的代謝分析

將KLDS 1.9201-4以3%（v/v）接種量接種于MRS broth中，在37℃下培養(yǎng)，每24 h傳代一次，每次傳代之前利用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值、利用HPLC測(cè)定葡萄糖和乳酸的含量。

1.4.1 乳酸含量測(cè)定

色譜分離柱為Waters Park C18柱；檢測(cè)器為UV214 nm。流動(dòng)相A為濃度0.02 mol/L的NaH2PO4，流動(dòng)相B為乙腈，A與B的比例是為9∶1；流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。 取發(fā)酵液50 mL，以10 000 g，4℃下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)適當(dāng)稀釋進(jìn)行色譜分析[3]。

1.4.2 葡萄糖含量測(cè)定

色譜分離條件：色譜柱為氨基柱；柱溫為30℃；流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL；檢測(cè)器為折光。取發(fā)酵液50 mL，以10 000 g，4℃下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)適當(dāng)稀釋進(jìn)行色譜分析[3]。

1.5 菌株的RAPD分析

1.5.1 基因組DNA的提取

采用天根基因組提取試劑盒提取KLDS 1.9201-4的基因組DNA，具體的操作方法按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。分別提取KLDS 1.9201-4第1代和第8代的基因組DNA，取1 μL DNA樣品，稀釋200倍后，測(cè)定OD260和OD280。選取濃度1.8≤OD260/OD280≤2.0的樣品。然后，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 mg/L作為模板備用。

1.5.2 RAPD的引物和擴(kuò)增條件

根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]，從20種引物中篩選出多態(tài)性良好的適宜引物序列，其中引物1的序列為：5’GAGCGGC CAAAGGGAGCAGAC3’；引物2序列為：5’AACAGCTATGACCATG3’； 引物3序列為：5’CCGCAGCCAA3’。

PCR體系為25 μL： 滅菌ddH2O 15 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，DNA模板2 μL，引物1 μL，MgCl21.5 μL，Taq酶0.4 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性5 min，40℃退火5 min，72℃延伸5min，4 cycles；94℃變性1 min，55℃退火1min，72℃延伸2 min，30 cycles；72℃10 min。

1.5.3 電泳和凝膠成像分析

將3種引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為100 V，電泳2 h后在紫外燈下觀察并拍照記錄結(jié)果，隨后對(duì)DNA指紋圖譜的變化情況進(jìn)行比較分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS11.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中每組試驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)變化

將突變菌株KLDS 1.9201-4進(jìn)行了連續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳至第9代時(shí)突變菌株又恢復(fù)了原來(lái)的產(chǎn)酸能力，因此傳代試驗(yàn)在第10代就結(jié)束了。第1代和第8代的菌體形態(tài)分別如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可以看出，在連續(xù)傳代8次后，突變菌株的表型特征沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。

2.2 菌株的生長(zhǎng)代謝情況

將KLDS 1.9201-4進(jìn)行連續(xù)傳代，發(fā)酵液的pH值、葡萄糖和乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

由圖3可以看出，在傳代過(guò)程中隨著傳代次數(shù)的增加，突變菌株KLDS 1.9201-4發(fā)酵終點(diǎn)的pH值逐漸降低，一直傳代到第8代時(shí)發(fā)酵終pH值仍然大于4.2，直到第9代時(shí)發(fā)酵終pH開(kāi)始低于4.2，也就是說(shuō)突變菌株可能發(fā)生了回復(fù)突變，不再具有弱后酸化能力。

由圖4可以看出，在傳代過(guò)程中隨著傳代次數(shù)的增加，發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸減少，也就是說(shuō)突變菌株KLDS 1.9201-4對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖的代謝能力逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)乳酸量也逐漸增加。當(dāng)傳代到第9代時(shí)，KLDS 1.9201-4對(duì)葡萄糖的代謝量顯著增加，發(fā)酵液中的乳酸質(zhì)量濃度也陡然增加，這表明突變菌株可能發(fā)生了回復(fù)突變，恢復(fù)了親本菌株的產(chǎn)酸能力。

2.3 RAPD分析結(jié)果

用篩選出的3種引物對(duì)傳代不同次數(shù)的菌株進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果如圖5～圖7所示。

由圖5～圖7可以看出，在連續(xù)傳代9次后，RAPD指紋圖譜結(jié)果表明，利用引物1、2、3進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，突變菌株KLDS 1.9201-4的基因組DNA指紋圖譜基本沒(méi)有變化，隨機(jī)擴(kuò)增條帶數(shù)相同且亮度接近，說(shuō)明其基因組DNA具有高度的同源性，并沒(méi)有隨著菌株弱后酸化能力的丟失而發(fā)生變化。然而，突變菌株KLDS 1.9201-4的代謝情況分析表明，其在第9代時(shí)已經(jīng)恢復(fù)了原來(lái)的產(chǎn)酸能力，這表明其可能發(fā)生了回復(fù)突變。雖然Fani等的研究表明，RAPD技術(shù)可作為評(píng)估菌株在環(huán)境中遺傳穩(wěn)定性的一種有效技術(shù)手段[7]，但是本研究的結(jié)果表明RAPD技術(shù)可能并不適合用來(lái)評(píng)估所有細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性。

3 討 論

細(xì)菌在經(jīng)過(guò)多次連續(xù)傳代培養(yǎng)之后容易發(fā)生退化現(xiàn)象[8]，其遺傳穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其相應(yīng)的表型特征的改變，尤其是生理生化特性的改變，這樣在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中就可能引起發(fā)酵失敗，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[9]。因此，一般的工程菌株都具有很好的遺傳穩(wěn)定性，這樣才能實(shí)現(xiàn)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。然而，對(duì)直投式酸奶發(fā)酵劑來(lái)說(shuō)，如果菌株的穩(wěn)定性特別好，那么酸奶生產(chǎn)廠家就可通過(guò)單次購(gòu)買直投式發(fā)酵劑而獲得該菌株，從而能夠自己生產(chǎn)酸奶發(fā)酵劑，不利于知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，因此，直投式酸奶發(fā)酵劑必須具有適宜的遺傳穩(wěn)定性[10]。本研究中HPLC分析表明，突變菌株KLDS 1.9201-4從第9代開(kāi)始就恢復(fù)了親本菌株的產(chǎn)酸能力，也就是說(shuō)它不再具有弱后酸化的能力。然而，RAPD分析的結(jié)果卻表明KLDS 1.9201-4在第9代仍然能夠穩(wěn)定遺傳，這可能是因?yàn)楸狙芯恐兴捎玫囊锴『貌荒軘U(kuò)增出基因組中發(fā)生回復(fù)突變的核苷酸序列，也可能是RAPD技術(shù)并不適用于評(píng)估突變菌株KLDS 1.9201-4的遺傳穩(wěn)定性。因此，如果要想確定突變菌株發(fā)生回復(fù)突變的核苷酸序列，那么就需要進(jìn)一步對(duì)親本和突變菌株進(jìn)行全基因測(cè)序分析，目前，親本和突變菌株的全基因組測(cè)序工作正在華大基因公司進(jìn)行。綜上所述，本研究中的具有弱后酸化能力的德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS 1.9201-4能夠穩(wěn)定遺傳至第8代，這個(gè)特性不但對(duì)直投式發(fā)酵劑的生產(chǎn)沒(méi)有任何不良影響，而且還非常有利于知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，能夠有效的避免菌株資源被竊取。因此，突變菌株KLDS 1.9201-4在傳代過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性恰好能夠被應(yīng)用于制作弱后酸化酸奶發(fā)酵劑。

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Genetic stability of Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus mutant stain with low post-acidification

LIU Fei1,2,JIAO Yue-hua3,GUO Wen-kui1,YU Wei1,GU Chun-tao1,GAO Xue-jun1
（1.Key laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Postdoctoral Research Station of Food Science and Engineering,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China,2.Danisco（China）Co.,Ltd.,Kunshan 215300,China,3.Center of Drug Safety Evaluation,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China）

The genetic stability of a mutant with reduced membrane-bound H+-ATPase activity from L.delbrueckii subsp.bulgaricus originated from the traditional dairy product was studied to develop a yoghurt starter culture with low post-acidification capacity.The mutant was propagated in MRS broth continuously,the morphological trait of mutant was examined by microscope,the glucose and lactic acid content of supernatant of fermented broth was determined by HPLC,and the genome DNA stability was analyzed by RAPD.The result showed that the low post-acidification capacity of mutant strain was still stable while being propagated in MRS broth continuously after eight generation.During this period,the morphological trait of mutant cell didn’t change,the glucose content fermented by KLDS 1.9201-4 and the content of lactic acid of fermented broth increased gradually.Furthermore,the RAPD results showed that the genome DNA of KLDS 1.9201-4 was stable all the time.Thus the L.delbrueckii subsp.bulgaricus mutant KLDS 1.9201-4 with reduced membrane-bound H+-ATPase activity had adequate genetic stability,which could be applied to develop yoghurt starter culture with lower post-acidification.

Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus;genetic stability;mutant;post-acidification

Q935

A

1001-2230（2012）09-0011-04

2012-02-08

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目（12511051）。

劉飛（1980－），男，博士，主要研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。

高學(xué)軍