楊 勇，呂進(jìn)泉，趙文生

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是由于肺循環(huán)受限引起肺血管阻力進(jìn)行性增加，最終導(dǎo)致右心衰竭的綜合征。病情進(jìn)展迅速，預(yù)后極差[1]。本研究通過(guò)大劑量外源性水飛薊素干預(yù)經(jīng)腹腔注射野百合堿(MCT)復(fù)制的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，觀察肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺血管重構(gòu)及Fas mRNA的表達(dá)變化，探討水飛薊素對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺血管重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體質(zhì)量230～250 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2儀器與試劑 MCT(美國(guó)Sigma公司)；水飛薊素(天津天士力制藥股份有限公司),Medlab-U/8C502生物信號(hào)處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)；Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀C1000(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BM0002)；RT試劑盒(Fermentas中國(guó)公司，貨號(hào)：K1622)；熒光定量PCR試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)；TUNEL凋亡試劑盒(南京凱基)；Fas引物序列(擴(kuò)增產(chǎn)物198 bp,上海生工生物工程有限公司):上游5′-TGA AGA CAT CCT TGA GCC TTG-3′,下游5′-AGA TTC ATT GGC ACA CTT TCA G-3′；β-actin引物序列(擴(kuò)增產(chǎn)物207 bp,上海生工生物工程有限公司)，上游5′-CAC CCG CGA GGT CAA CCT TC-3′,下游5′-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3′。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備與干預(yù) 隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、MCT誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓模型組(M組)、水飛薊素治療組(S組)，每組8只。MCT先溶于1 mol/L濃鹽酸，加去離子水，然后用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH至7.4，最終配置成濃度20 mg/mL野百合堿溶液。M組、S組大鼠一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg,C組一次性腹腔注射生理鹽水3 mL/kg。將水飛薊素用生理鹽水配成50 mg/mL溶液，S組自第2天開始按照水飛薊素每次150 mg/kg，每天灌胃3次，共27 d。M組和C組用生理鹽水每次2 mL/kg，每天灌胃3次。

1.4觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1右心導(dǎo)管法測(cè)定平均右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP) 28 d后，記錄大鼠質(zhì)量，右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓,大鼠以200 mg/mL烏拉坦麻醉(2.5 mL/kg)后用聚氯乙烯導(dǎo)管插入右頸外靜脈,緩慢進(jìn)入右心房、右心室,導(dǎo)管內(nèi)加入肝素鹽水,測(cè)壓導(dǎo)管接壓力傳感器記錄壓力變化。

1.4.2心肺組織取材 完成肺動(dòng)脈壓測(cè)量后，取出分離心肺組織。測(cè)量心指數(shù):分離右心室，除去心耳、心房，用濾紙吸去血液、鹽水。分別稱取右心室和左心室加室間隔的質(zhì)量，右心室肥大指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)=右心室質(zhì)量/(左心室質(zhì)量+室間隔質(zhì)量)。右肺以40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，用HE染色、α-SMA免疫組織化學(xué)染色、TUNEL法檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。左肺置于液氮中凍存，用于Fas mRNA半定量RT-PCR檢測(cè)。

1.4.3HE染色 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色，脫色透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺動(dòng)脈大體形態(tài)變化。

1.4.4肺動(dòng)脈α-SMA免疫組織化學(xué)染色 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，SP法檢測(cè)α-SMA抗原的表達(dá)，1∶100稀釋一抗，DAB顯色。胞質(zhì)棕黃色著色為陽(yáng)性信號(hào)。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取50～100 μm血管20根，取平均光密度值(平均光密度值=累積光密度/面積)評(píng)價(jià)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖程度。

1.4.5TUNEL法檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡 肺組織切片脫蠟至水，參照TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定：顯微鏡下隨機(jī)選取50～100 μm左右的肺動(dòng)脈，計(jì)數(shù)500個(gè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，求得凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.6肺組織Fas mRNA RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol法提取肺組織總RNA,核酸蛋白分析儀測(cè)總RNA的純度。cDNA第一鏈的合成和熒光定量PCR過(guò)程采用RT試劑盒和熒光定量PCR試劑盒，按照說(shuō)明書操作。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，按下列步驟擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后一個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

2 結(jié) 果

2.1RVSP及RVHI的變化 與C組相比，MCT誘發(fā)28 d后，M組的RVSP 及RVHI明顯升高(P<0.05)。經(jīng)干預(yù)后，S組RVSP及RVHI低于M組(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠RVSP 和RVHI變化的比較

表2 3組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞α-SMA、凋亡指數(shù)及肺組織Fas mRNA表達(dá)的比較

2.2肺組織HE染色、α-SMA免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞凋亡指數(shù)、Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量 HE染色所見：C組(封3圖1A)肺動(dòng)脈管壁菲薄；S組(封3圖1B)肺動(dòng)脈管壁較C組明顯增厚，但較M組薄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；M組(封3圖1C)肺動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與M組(封3圖2A)比較，C組(封3圖2B)α-SMA表達(dá)低(P<0.01)、Fas mRNA表達(dá)高(P<0.01)、細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)，S組(封3圖2C)α-SMA表達(dá)低(P<0.01)、Fas mRNA表達(dá)高(P<0.01)、細(xì)胞凋亡指數(shù)稍升高,見表2。

3 討 論

目前，研究認(rèn)為，炎癥、過(guò)氧化物、遺傳基因等多種因素?fù)p傷肺微小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是肺動(dòng)脈高壓(PAH)發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[2]。肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、平滑肌細(xì)胞和纖維原細(xì)胞活化、血管壁細(xì)胞間交互作用、循環(huán)祖細(xì)胞黏附、血管壁的持續(xù)性收縮是PAH血管重構(gòu)主要機(jī)制[3]。SD大鼠腹腔注射MCT后，藥物經(jīng)肝臟代謝生成五元雜環(huán)的吡咯MCT，可特異性損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞增生、肺動(dòng)脈壓力增高，復(fù)制肺動(dòng)脈高壓模型[4]。

本實(shí)驗(yàn)給予大劑量水飛薊素干預(yù)S組大鼠后，S組大鼠糞便稍有稀爛改變，1周后好轉(zhuǎn)，未見其他不良反應(yīng)。給予大劑量水飛薊素干預(yù)S組大鼠，大鼠RVSP下降，肺血管重構(gòu)的病理改變減輕，說(shuō)明大劑量水飛薊素干預(yù)可以減輕肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺血管的重構(gòu)，改善肺動(dòng)脈高壓癥狀。其機(jī)制可能為：(1)抗氧化作用。氧化損傷可以通過(guò)損傷血管內(nèi)皮、促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管外基質(zhì)增生等多條途徑參與肺血管重構(gòu)[5]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞內(nèi)重要的具有氧化還原潛能的氧衍生物，參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種功能調(diào)控[6]。水飛薊素具有良好的抗氧化和自由基清除活性[7]。水飛薊素可以抑制細(xì)胞與組織ROS的產(chǎn)生，并促進(jìn)細(xì)胞組織產(chǎn)生超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px),通過(guò)抑制氧自由基的過(guò)度產(chǎn)生和促進(jìn)氧自由基降解酶生成抑制細(xì)胞損傷及血管重構(gòu)。(2)抗炎作用。研究顯示炎癥反應(yīng)參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞、IL-1、IL-6、TNF-α、PDGF、VEGF等炎癥因子均參與了內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管壁重構(gòu)[8-10]。水飛薊素可以通過(guò)抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性、清除活性氧自由基等機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到大劑量水飛薊素干預(yù)后肺微小動(dòng)脈周圍炎癥反應(yīng)減輕,證實(shí)水飛薊素可以通過(guò)抗炎作用減輕血管重構(gòu)。(3)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素干預(yù)MCT誘發(fā)PAH模型大鼠可以提高肺組織Fas mRNA表達(dá)，肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡增多，可部分調(diào)節(jié)血管平滑肌的增殖與凋亡平衡，具體機(jī)制尚不明確[13]。(4)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotenases,MMPs)大量分泌可以降解彈力纖維，破壞正常膠原結(jié)構(gòu)，誘發(fā)肺小動(dòng)脈重構(gòu)。水飛薊素可以通過(guò)降低細(xì)胞MMPs表達(dá)水平，抑制膠原合成，發(fā)揮對(duì)組織的保護(hù)作用[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大劑量水飛薊素可以減輕MCT誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織Fas mRNA表達(dá)，提高肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管平滑肌細(xì)胞凋亡，降低RVSP，減輕肺動(dòng)脈重構(gòu)變化，對(duì)MCT誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓大鼠具有保護(hù)作用。

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