馮沖,耿濤,王艷穎,劉艷麗,宋安東

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州,450002) 2(中州大學(xué)實驗管理中心,河南鄭州,450044)

纖維質(zhì)水解液發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂＊

馮沖1,2,耿濤1,王艷穎1,劉艷麗2,宋安東1

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州,450002) 2(中州大學(xué)實驗管理中心,河南鄭州,450044)

為提高發(fā)酵性絲孢酵母對纖維質(zhì)水解液的適應(yīng)性,對該菌株進(jìn)行了馴化。利用馴化后的菌株發(fā)酵纖維質(zhì)水解液生產(chǎn)生物油脂,并對纖維質(zhì)水解液發(fā)酵體系進(jìn)行優(yōu)化。通過搖瓶培養(yǎng)試驗,得到了優(yōu)化體系。結(jié)果表明:馴化后的菌株發(fā)酵纖維質(zhì)水解液的糖利用率比原來提高了 37.2%,生物量提高了 24.3%,油脂含量提高了18.3%,油脂濃度提高了 45.6%。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為:初始糖濃度 60～80 g/L,初始 pH 6.0,質(zhì)量比 3∶1的酵母粉 +(NH4)2SO4復(fù)合氮源。在該條件下,可得菌體生物量、油脂含量和油脂濃度分別為 22.6 g/L、46.3%和10.5 g/L。同時對其生物油脂的成分進(jìn)行了分析。

發(fā)酵性絲孢酵母,馴化,纖維質(zhì)水解液,發(fā)酵條件,生物油脂

自然界存在少數(shù)微生物在適宜條件下能將碳水化合物、碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化為油脂而大量貯存,菌體油脂含量最高可超過其干重的 70%[1]。已知細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類中都有能積累油脂的菌株,但以酵母菌和霉菌類真核微生物居多[2]。利用微生物生產(chǎn)油脂是開發(fā)新的油脂資源的重要方向。但是由于微生物油脂生產(chǎn)成本較高,為降低生產(chǎn)成本,便于實現(xiàn)規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn),有必要把微生物油脂生產(chǎn)轉(zhuǎn)向利用一些農(nóng)副產(chǎn)品和工業(yè)廢物[3]。研究表明,微生物能高效利用半纖維素和纖維素水解得到的所有碳水化合物產(chǎn)生油脂,和當(dāng)前乙醇發(fā)酵工藝相比具有明顯的原材料資源優(yōu)勢,對解決生物質(zhì)經(jīng)濟公認(rèn)的世界難題之一“全糖轉(zhuǎn)化利用”很有價值[4]。國外學(xué)者也曾報道產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化五碳糖為油脂的例子[5]。纖維素是地球上最豐富、最廉價的資源。全世界每年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈約 1 000～2 000億 t[6],我國每年達(dá) 7億 t以上,其中玉米秸稈達(dá) 2億多噸[7]。是生物轉(zhuǎn)化生物油脂潛在而豐富的原料。目前國內(nèi)外還很少報道利用廢棄農(nóng)作物稈秸生產(chǎn)生物油脂。本文以玉米秸稈稀酸水解糖化液為原料對發(fā)酵性絲孢酵母的產(chǎn)脂能力進(jìn)行了馴化,對馴化后的菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

發(fā)酵性絲孢酵母 (Trichosporon fer m entans) IFFI01368,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。1.1.2 麥芽汁培養(yǎng)基

糖度為 12～13°Bé的麥芽汁,作為酵母菌活化和保藏培養(yǎng)基。

1.1.3 01368種子培養(yǎng)基 (g/L)

葡萄糖 15,(NH4)2SO42.5,酵母膏 1,蛋白胨7,KH2PO47,Na2HPO42,MgSO4·7H2O 2,微量元素1 mL/L,pH值 6.0。

微量元素的組成 (mg/mL):CaCl2·2H2O 1.2,FeSO4·7H2O 10,ZnSO4·7H2O 0.5,CuSO4·5H2O 1.0,MnSO4·4H2O 1.0。

1.1.4 纖維質(zhì)水解液配制[8]

粉碎 100目的玉米秸稈粉,按 1∶6(g∶mL)加入1%的稀硫酸 121℃蒸汽預(yù)處理 1 h后按 1∶4(g∶mL)加入蒸餾水,冷卻后,調(diào) pH 4.8左右,按 100∶3分別加入纖維素酶和木聚糖酶,放糖化罐 (48℃,150 r/min)中糖化 48 h,取出過濾、脫毒即得。測得玉米秸稈的總還原糖濃度為 4.5% ±0.5%,經(jīng)測定葡萄糖和木糖占總還原糖的 82% ±4%。

1.1.5 玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)

還原糖 80,(NH4)2SO40.5,KH2PO45,MgSO4·7H2O O.1,酵母粉 2。

1.1.6 馴化培養(yǎng)基

將還原糖濃度 80 g/L的玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基和純葡萄糖液體培養(yǎng)基,分別按體積比 (1∶4,2∶3,3∶2,4∶1,5∶0)配置成不同濃度梯度的馴化培養(yǎng)基。其中 pH為 5.5～6.0。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將菌株 01368轉(zhuǎn)接到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng) 48 h。

1.2.2 種子液的制備

將活化的菌種從斜面培養(yǎng)基中挑取適量,接入含有 50 mL種子液培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中,振蕩培養(yǎng) 24 h,溫度 28℃,轉(zhuǎn)速 150 r/min。

1.2.3 菌種馴化培養(yǎng)方法

將種子液轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)基中 (1∶4),在 28℃ ,150 r/min振搖培養(yǎng) 24 h,待菌體在馴化培養(yǎng)基中生長良好后,采用液-液轉(zhuǎn)接方式接種下一批馴化培養(yǎng)基 (2∶3),在 28℃,150 r/min的條件下振搖培養(yǎng) 24 h,不斷提高馴化培養(yǎng)基中玉米秸稈水解液的含量(每批增加 20%),直至菌種在 100%纖維質(zhì)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好后,將該馴化好的菌液接入種子培養(yǎng)基中,在 28℃,150 r/min的條件下振搖培養(yǎng)48 h。斜面冷藏保存。

1.2.4 菌株生長曲線的測定

將馴化后的種子液,按 10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,在 28℃,150 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng) 96 h,每隔 8 h取 1次樣,測定其在 721型可見分光光度計(上海金鵬分析儀器有限公司)660 nm處吸光度(空白培養(yǎng)基為對照)。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)

將種子液按 10%的接種量轉(zhuǎn)接于纖維質(zhì)糖化液培養(yǎng)基中,進(jìn)行振蕩培養(yǎng) 72 h,溫度 28℃,轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2.6 生物量的測定[3]

通過 4 500 r/min離心l5 min,收集菌體并干燥(干燥溫度:80℃)至恒重,準(zhǔn)確稱取干菌體量。

1.2.7 油脂抽提[9]

精確稱取一定量粉碎后的干菌體,每克干菌體添加 40 mL HCl水解,室溫下靜置 20 min,沸水浴加熱10 min,加入適量 V(CHCl3)∶V(甲醇 )=2∶1,振蕩 30 min,然后在 4 500 r/min下離心 l5 min,分液,取CHCl3層,真空干燥除去氯仿即得油脂,計算油脂得率。

油脂含量 /%=粗油脂重量 (g)/菌體干重 (g)油脂濃度 =粗油脂 (g)/發(fā)酵液 (L)

1.2.8 總糖測定

采用 DNS法,木糖測定采用地衣酚法。

1.2.9 氣相色譜,質(zhì)譜分析條件

色譜:色譜柱 TR-5 ms毛細(xì)管柱,30 m×0.25 mm ×0.25μm;載氣:高純氦氣,柱流量:1 mL/min;進(jìn)樣口:280℃,分流比:100;程序升溫:初溫 100℃,升溫速率 15℃/min,終溫 250℃,保持 10 min。

質(zhì)譜:離子源:EI轟擊源;電子能量:70 eV;離子源溫度:250℃;傳輸線溫度:250℃;電子倍增電壓:1.135 kV;掃描質(zhì)量范圍:33～430 amu;采樣速率:5次/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵性絲孢酵母的馴化

2.1.1 發(fā)酵性絲孢酵母的生長曲線

每隔 8 h取 1次樣品,測定其在可見分光光度計660 nm的吸光度,結(jié)果如圖 1。

圖 1 馴化前后發(fā)酵性絲孢酵母的生長曲線

由圖 1可知,馴化后的發(fā)酵性絲孢酵母 8～64 h處于對數(shù)生長期,72 h時酵母基本停止生長,其后菌體濃度開始下降。

2.1.2 馴化前后發(fā)酵性絲孢酵母的發(fā)酵情況比較

秸稈水解液中有很多對微生物細(xì)胞的生長和代謝有抑制作用的毒性物質(zhì),如糠醛、己糖酸、甲酸、乙酸等[10-11]。通過在 100%纖維質(zhì)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基多次馴化直至菌株生長穩(wěn)定,從中挑出較好的馴化結(jié)果 ,如表 1

表1 發(fā)酵性絲孢酵母馴化前后發(fā)酵玉米秸稈水解液產(chǎn)脂能力比較

由表 1可知,馴化后的發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵玉米秸稈糖化液的糖利用率提高了 37.2%,生物量提高了 24.3%,油脂含量提高了 18.3%,油脂濃度提高了45.6%。該菌株經(jīng)馴化后顯著地提高了對發(fā)酵抑制物的耐受力,從而增加了還原糖利用率和生物量、油脂含量、油脂濃度。

2.2 發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液條件優(yōu)化

2.2.1 初始糖濃度的確定

為了確定發(fā)酵的最適濃度,采用了一系列不同的初始糖濃度,秸稈液還原糖濃度分別為 20,40,60,80,100 g/L進(jìn)行考察,接種量 10%,在 28℃ ,150 r/min的條件下發(fā)酵 4 d,分別測定生物量、油脂含量、油脂濃度,結(jié)果如圖 2。

圖 2 初始糖濃度對菌體生長和油脂合成的影響

由圖 2知,初始糖濃度為 60 g/L時,生物量和油脂濃度均最高分別為 20.2、8.5 g/L,而油脂含量卻在 80 g/L時達(dá)最高,為 44.4%,其后隨著初始糖濃度的增加而降低。綜合考慮,選取 60～80 g/L為發(fā)酵的最適初始糖濃度。

2.2.2 初始 pH值的確定

不同微生物有不同的最適 pH值,對大多數(shù)真菌來說,真菌有保持其體內(nèi)酸堿度偏酸性的能力,這樣有利于菌體進(jìn)行正常的新陳代謝和各種酶反應(yīng),但介質(zhì)的 pH值對菌體的新陳代謝和生長也有一定的影響,因為一些酶的活性受到環(huán)境中 H+濃度直接影響,改變 H+濃度對改善發(fā)酵過程中某些酶的活性可能有很大影響。本試驗將種子液轉(zhuǎn)接入玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基 (初始 pH值分別為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)中 ,于 28 ℃下振蕩培養(yǎng) 96 h,轉(zhuǎn)速為150 r/min。結(jié)果見圖 3。

由圖 3可以看出,pH值 6.0時,菌體生物量、油脂含量及油脂濃度都最高,分別為20.6 g/L、46.1%、9.5 g/L?？赡芤驗?pH值 6.0時菌體內(nèi)各種酶的活性較高,偏離這個值,細(xì)胞生長較慢,從而影響了油脂合成。由此可見,初始糖濃度為 60～80 g/L的玉米秸稈水解液,初始 pH值在 6.0左右發(fā)酵效果最好。

圖 3 pH對菌體生長和油脂合成的影響

2.2.3 氮源對菌體生長和油脂合成的影響

由于秸稈中的碳氮比較高,氮源的作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長,在嚴(yán)重缺氮的情況下,可以觀察到大量油脂的積累。據(jù)報道,C/N比為 80∶1為最佳[12](C/N比是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中所含的碳源中碳原子的質(zhì)量與氮源中氮原子的質(zhì)量之比,其中酵母粉中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 12%的碳和 7%的氮)。試驗中以 C/N為 80∶1為前提,分別采用酵母粉 2.9 g/L、(NH4)2SO40.9 g/L、尿素 0.43 g/L、酵母粉 0.7 g/L+ (NH4)2SO40.7 g/L、酵母粉 0.37 g/L+尿素 0.37 g/L等 (初始糖濃度 80 g/L的玉米秸稈水解液,pH6.0)考察氮源的情況,結(jié)果見表 2。

表2 不同氮源對菌體生長和油脂合成的影響

從表 2可以看出,用尿素為氮源時,菌體生物量最高,為 22.4 g/L,但油脂含量、油脂濃度不高。當(dāng)補加有機和無機復(fù)合氮源 [酵母粉 + (NH4)2SO4]時,油脂含量和油脂濃度最高分別為 47.6%和 9.6 g/L。可能是菌體先利用無機氮源,然后有機氮源作為補充,從而有利于油脂的積累。并且 (NH4)2SO4成本低,便于擴大生產(chǎn)。綜合考慮選用酵母粉 +(NH4)2SO4為優(yōu)化氮源。

2.2.4 復(fù)合氮源比對菌體生長和油脂合成的影響

由于在氮源優(yōu)化中復(fù)合氮源 (酵母粉 +硫酸銨)有利于菌體生物量和油脂積累,所以有必要對復(fù)合氮源進(jìn)一步優(yōu)化。以 C/N為 80∶1,酵母粉和硫酸銨質(zhì)量比為 1∶3,1∶1,3∶1,5∶1等 (初始糖濃度 80 g/L的玉米秸稈水解液,pH6.0)考察氮源的情況,結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合氮源比對菌體生長和油脂合成的影響

從表 3可以看出,當(dāng)復(fù)合氮源比 (酵母粉∶硫酸銨)為 3∶1時,最有利于菌體生物量和油脂的積累,菌體生物量、油脂含量和油脂濃度分別為 22.6 g/L、46.3%和 10.5 g/L。由于有機氮源成分復(fù)雜,不僅為菌體生長提供氮源、碳源,還為菌體生長提供了必需的生長因子,可能是該菌體利用有機氮源的碳源較多,所以有機氮源的過量加入有利于菌體的生長,反而不利于油脂積累,所以復(fù)合氮源酵母粉+(NH4)2SO4質(zhì)量比為 3∶1時為優(yōu)化結(jié)果。

2.2.5 菌株 01368在纖維質(zhì)水解液發(fā)酵體系中產(chǎn)生物油脂脂肪酸組成分析

菌株 01368生物油脂經(jīng)甲酯化后通過 GC-MS對其脂肪酸成分進(jìn)行鑒定分析,其主要脂肪酸成分及含量如表 4所示。

表4 01368菌體油脂脂肪酸組成

由表 4可知,發(fā)酵性絲孢酵母油脂中主要脂肪酸成分以十六碳酸 (C16∶0)含量為最高,約占脂肪酸總量的 29.03%;余下依次是油酸 (C18∶1)約占 25.86%;亞油酸占 12.95%;十八碳酸 (C18∶0)為 12.88%;等等。其中 C16-C18的脂肪酸含量約為 81.78%,這與生物柴油脂肪酸組分相近。

3 結(jié)論與討論

(1)馴化后的發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵玉米秸稈糖化液的糖利用率提高了 37.2%,生物量提高了24.3%,油脂含量提高了 18.3%,油脂濃度提高了45.6%。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為:初始糖濃度 60～80 g/L,初始pH值 6.0,質(zhì)量比3∶1的酵母粉+(NH4)2SO4復(fù)合氮源。在該條件下,可得菌體生物量、油脂含量和油脂濃度分別為 22.6 g/L、46.3%和10.5 g/L。

(2)對本試驗所獲得的生物油脂的脂肪酸成分及含量進(jìn)行了分析,其主要成分為:十六碳酸,十七碳酸,十八碳酸,油酸,亞油酸,等等。其中 C16-C18的脂肪酸含量約為 81.78%,這與生物柴油脂肪酸組分相近,基本滿足了生物柴油原料的要求。

(3)纖維質(zhì)原料來源廣泛適合生物柴油生產(chǎn)。生物柴油原料的可持續(xù)生產(chǎn)供應(yīng)最終將成為生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸,從長遠(yuǎn)來看,如果大面積種植專用能源作物,將導(dǎo)致生物柴油作物與糧食作物在耕地上產(chǎn)生矛盾,而且大規(guī)模種植少數(shù)幾種樹木,也將造成物種與生態(tài)失衡的問題。利用成本較低的農(nóng)作物秸稈作為發(fā)酵產(chǎn)品的原料是今后重要的研究方向。

(4)纖維質(zhì)在水解過程中會產(chǎn)生一些對產(chǎn)脂菌有毒性的物質(zhì),影響酵母細(xì)胞生長和代謝酶的活性。因此需要對纖維質(zhì)水解液進(jìn)行脫毒處理,以提高油脂生產(chǎn)率。

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Research on Fermentation Conditions of Bio-oil Production from Fiber Hydrolyzate

Feng Chong1,2,Geng Tao1,Wang Yan-ying1,Liu Yan-li1,Song An-dong1

1(College ofLife Science,Henan AgriculturalUniversity,Zhengzhou 450002,China)2(ExperimentalManagement Centre,Zhongzhou University,Zhengzhou 450044,China)

Trichosporon fer m entans(TF)was domesticated to i mprove adaptability in fiber hydrolysate.Fer mentation system from fiber hydrolysate by the domesticated TF have been optimized.By the flask experimentsof several single conditionswhich affect TF growth and fat synthesis,the optimal fer mentation conditionswere studied.After domestication,the transform rate of sugar increase 37.2%,the biomass increase 24.3%,lipid content increase18.3%and lipid concentration increase 45.6%.The optimum fermentation conditionswhichwere determined on the basisof a single test to be as follows:concentration of sugar,60～80 g/L,pH 6.0,quality ratio of yeast+(NH4)2SO43∶1.On the optimum condition,the biomass,lipid content and lipid concentration is 22.6 g/L,46.3%,and 10.5 g/L,respectively.At the same time,the composition of bio-oilwas analyzed.

Trichosporon fer m entans,domestication,fibre hydrolysate,fermentation condition,Bio-oil

碩士,講師 (宋安東教授為通訊作者)。

＊國家自然科學(xué)基金 (70741032);國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項目(2006D00070597);河南省科技攻關(guān)重點項目(092102210110)

2010-08-28,改回日期:2010-12-16